2015 Fiscal Year Research-status Report
精密代謝分析にもとづく高級アルコール高生産酵母の構築
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15K06579
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 史生 大阪大学, 情報科学研究科, 准教授 (50462734)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 代謝工学 / 出芽酵母 / メタボローム分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)絶対定量法の確立：酵母細胞内の解糖系中間体すべての濃度を絶対定量する手法を確立した。まず、抽出時の代謝停止法などに検討を加え、高効率な手法を見いだした。ついでLC-MSをもちいた解糖系代謝中間体測定法をATPやNADHなどの補酵素類の測定へ拡張した。これにより、解糖系の7反応のギブス自由エネルギー変化を解析可能にした。
(2)エタノール生合成遮断酵母株の分析（松田）: これまでに構築していた、ADH多重破壊株(BY4939 adh1Δadh2Δadh3Δadh4Δadh5Δ)、およびPDC多重破壊株(YPH499 MTH1ΔT pdc1Δpdc5Δpdc6Δ)について解析を行った。エタノール生合成を遮断することで、ピルビン酸および還元力が過剰となり他のアルコール生合成経路へとオーバーフローすることが期待される。絶対定量値から解糖系各反応のギブス自由エネルギー変化（ΔG）を算出したところ、いずれの反応のΔGも大きく負に変化しておらず、むしろ正に増加する傾向があった。また、細胞内含量がミカエリス定数に比べて著しく増加した反応も見られなかった。この結果から、代謝律速点は今回の解析に含まれなかったグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) 反応か、ピルビン酸変換部分にあると推測され、さらに、エタノール生合成遮断酵母株においても代謝物蓄積量に大きな変化がなく、代謝恒常性を維持しているという知見が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27年度の研究課題のうち、抽出時の代謝停止法の検討、酵母細胞内の解糖系中間体すべての濃度を絶対定量法、ギブス自由エネルギー変化の算出への応用を実施した。さらに、これまでに構築していた、ADH多重破壊株(BY4939 adh1Δadh2Δadh3Δadh4Δadh5Δ)、およびPDC多重破壊株(YPH499 MTH1ΔT pdc1Δpdc5Δpdc6Δ)について解析を完了させ、当初の計画通りにデータの取得を行った。また、データの解析の結果、解糖系各反応のギブス自由エネルギー変化（ΔG）から合理的に代謝律速点を絞り込むことができた。このように、精密に代謝を定量することで予想される結果を得ることができた。さらに、エタノール生合成遮断酵母株においても代謝物蓄積量に大きな変化がなく、代謝恒常性を維持しているという予期されない新たな知見を得ることができたことから、当初の計画通り以上に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)酵素量の解析：ピルビン酸変換部分およびグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) 反応の酵素に注目し、定量プロテオミクス法を用いて候補酵素タンパク質の含量の定量および、リン酸化状態の解析を行う。そのための必要なLC-MSを用いた定量プロテオミクス法は既に開発済みである。エタノール生合成を遮断した酵母と野生株酵母の酵素発現プロファイル、リン酸化状態を解析し、炭素フローの律速となる反応の特定および、その分子機構を酵素レベルで解明する。
(2)イソブタノール高生産株の作成：エタノール生合成を遮断した酵母細胞内の代謝律速を解消するための遺伝子改変を行う。さらにブタノール生合成経路を導入した株を構築し、エタノール、ブタノール収率および増殖速度を評価する。今年度の知見から、ピルビン酸を返還する反応の強化が重要であると示唆されている。そこで、イソブタノール生合成経路の初発酵素の遺伝子を複数個クローニングし、過剰発現することで活性の高い酵素の選抜する。また、解糖系中のリン酸化部位への変異導入等を行い、エタノール生合成を遮断した酵母細胞内での律速の解消を試みる。過去の研究で作成したイソブタノール生合成経路の遺伝子をもつプラスミドベクターを作成した酵母株に導入し、イソブタノール生産への影響を評価する。作成した株の精密代謝解析を行い、律速部位の変化を観察する。
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