2016 Fiscal Year Research-status Report
環境調和型材料創成を志向したシリカ重合促進タンパク質グラシン利用の基盤技術
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15K06581
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
清水 克彦 鳥取大学, 産学・地域連携推進機構, 准教授 (90326877)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有馬 二朗 鳥取大学, 農学部, 准教授 (80393411)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | グラシン / アミノペプチダーゼ / 人工遺伝子 / 緑色蛍光タンパク質 / シリカ / グルタチオンS-トランスフェラーゼ / ヒスチジン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
六放海綿類カイロウドウケツのシリカ骨格中に見出されたシリカ形成を促進する新規タンパク質グラシンについて，(1) グラシンの配列とシリカ形成との関係を明らかにし，シリカ形成におけるグラシンの分子機構を理解し，(2) グラシンやその部分ペプチドを組換えタンパク質と融合させ，組換えタンパク質のシリカへの固定化を試みることで，グラシンの新たなタンパク質固定化のタグとしての利用可能性を探ることを目的としている．昨年度は， (1) について，各領域，繰り返しのユニット，グラシン分子を発現するベクターの構築を行った．(2) については， Streptomyces septatus TH-2 aminopeptidase (SSAP) ，オワンクラゲ緑色蛍光タンパク質 (GFP)をモデルタンパク質とした融合タンパク質発現系を確立し，両融合タンパク質の発現と活性を確認した．
本年度は，(1) について，各領域，繰り返しのユニットを発現させたが，部分ペプチドが低分子のため，精製が困難であったことから，グラシン及びその部分配列をglutathione S-transferase (GST)との融合タンパク質として組換えタンパク質を発現させ，グルタチオンアフィニティクロマトグラフィーにより精製を行った．GST融合タンパク質は，領域によりシリカ形成促進活性が異なることを見出した． (2) については，グラシンがヒスチジンリッチであることからHisタグとして利用することを発案し，Ni-nitrilotriacetic acidカラムを用いて融合タンパク質の精製を試みた．GFP融合タンパク質は精製することに成功したが，SSAP融合タンパク質はカラムへの吸着が見られず精製に至らなかった．精製したグラシン-GFPをシリカに固定し，この融合タンパク質が固定化後も活性を保持していることを確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グラシンの各領域の機能を明らかにする実験の準備として，各領域，繰り返しのユニット，グラシン分子を発現するベクターの構築を昨年度に終え，組換えグラシンおよび部分配列を発現させたところ，部分配列は精製が困難であるという課題が生じた．そこで，グラシン及びその部分配列をGSTとの融合タンパク質として発現させ，グルタチオンアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製を行った．各融合タンパク質は良好に精製された．GST-グラシン融合タンパク質は，シリカ形成促進活性が備わることを確認した．また，GST-グラシン部分配列融合タンパク質は，グラシンの領域により異なるシリカ形成促進活性が見られた．この結果は，当初の目標を達成したものといえる．
タンパク質の固定化においては，GFPの場合，融合タンパク質の精製と固定化を行い，固定化タンパク質の活性保持を確認することができた，当初の目標を達成した．一方，SSAPにおいては，グラシンがHisタグとして機能しなかったことから，グラシン-SSAP融合タンパク質については固定化を行うことができなかった．この課題については，グラシンとSSAPの間にリンカー配列を挿入する，あるいはGST-グラシン融合タンパク質を用いて固定化を行ってみるなど，来年度さらに検討することとする．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では，(1) グラシンの配列とシリカ形成との関係を明らかにし，シリカ形成におけるグラシンの分子機構を理解し，(2) グラシンやその部分ペプチドを組換えタンパク質と融合させ，組換えタンパク質のシリカへの固定化を試みることで，グラシンの新たなタンパク質固定化のタグとしての利用可能性を探ることを目的としている．
最終年度となる来年度は，(1)について，今年度GSTとグラシンおよびその部分配列の融合タンパク質を用いて明らかにしたグラシンの領域特異性を再実験して確認するとともに，融合タンパク質からグラシンおよび部分配列を切断して分取したタンパク質についてもその領域特異性を確認することとする．走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡観察を行い，形成されるシリカ粒子と領域の関係を詳細に明らかにする予定である．(2)については，すでに固定化を確認したGFPについては定量的に評価を行うとともに，SSAPについてはリンカーを挿入しその効果を確認する．GST-グラシン融合タンパク質についても固定化とその評価を行い，グラシンを用いた固定化タグとしての有用性および汎用性を確認することする．さらに，グラシンの部分配列をGSTと融合したタンパク質を用いて，最小にして最大の固定化を付与する領域を特定して，本研究の目的を達成することとする．
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Research Products
(5 results)
