2015 Fiscal Year Research-status Report
合理的デザインによる高感度バイオ分子間相互作用検出用クッションタンパク質の創製
| Project/Area Number |
15K06582
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
今中 洋行 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (10379711)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | バイオ分子 / 固定化 / 相互作用 / タンパク質 / ペプチド |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
バイオ分子間相互作用を高感度で簡便，迅速に検出可能な革新的システムの確立を目指し，固体表面親和性ペプチドおよびクッションタンパク質をスペーサーとして利用する新しいアイデアに基づいたリガンド分子固定化法の検討を進めた．まず8残基のアミノ酸から構成されるStrepTagII(STII)をリガンドとし，多様な分子デザインを行い，その固定化形態が相互作用検出に及ぼす影響について比較評価した．リガンド分子の固定化には親水性ポリスチレンに親和性を示すPS-tagを用い，スペーサー（クッションタンパク質）として超好熱菌由来の単量体TkHIIならびに3量体のCutA1を利用した．STIIを束縛する3次元構造体であるコイルドコイル構造は人工配列のEK coilとした．様々なリガンド分子を発現するためのベクターを構築し，発現・精製後，アナライト分子であるHRP標識Streptavidin (SA)あるいはStrepTactin (ST)との相互作用を検出した．その結果，ペプチドの束縛ならびに空間的に有利となる配置となるようデザインすることで相互作用検出感度が顕著に向上することを見出した．また，金表面上でも相互作用検出に関する検討を行った．金親和性ペプチドを連結したCutA1中にリガンドペプチドSTIIを挿入し，QCMセンサーチップ上に固定化後，SAとの相互作用を検出したところスペーサーの長さに応じた検出量が得られた．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超好熱菌由来のモデルクッションタンパク質であるCutA1に分子デザインを施し，その調製を試み，高度な構造安定性に基づいた予測通り，リガンドペプチドおよびスペーサーとしてのCoiled coil配列を挿入しても安定性が維持されることが確認できた．さらにこれらの各種CutA1を表面親和性ペプチドを介して固定化し，アナライトとの相互作用を検出しリガンドの固定化形態が感度におよぼす影響を評価するという当初予定していた研究について，特に遅れはなく，順調に進展している．
|
| Strategy for Future Research Activity |
バイオ分子間相互作用検出の詳細な比較と汎用性の担保が可能となるシステムを確立すべく，CutA1をクッションタンパク質として用い，表面親和性ペプチドを連結した形の分子の固定化特性および固定化後の構造維持に関する詳細な解析を行う．リガンドペプチドの挿入による構造変化が特に見られなかったことおよびCoiled-coil構造などのユニット導入でも構造安定性に特に問題が生じなかったことをふまえ，ペプチドに加えて，より大きなタンパク質の挿入可能性について検討を進め，多様なバイオ分子間相互作用の検出への本技術の適用を目指す．また，親水性ポリスチレンならびに金に加え，金ナノ粒子を固定化基材として用い，バイオ分子固定化による機能化も検討する．これらの検討を通じて超高感度バイオ分子間相互作用検出システムの開発を進めるとともに，クッションタンパク質の実用化可能性について総合的に評価する．
|
| Causes of Carryover |
消耗品の購入についてわずかに見直しを行ったため未執行額が生じた．
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
設備備品の購入は予定せず，主に消耗品の購入への使用を予定している．内訳としては，試薬類，ガラス・プラスチック器具類，分取用カラム，金属ナノ粒子，金属平板，センサーチップ等の購入を想定している．また研究成果発表のための旅費や調査・研究旅費，研究成果投稿料に関する支出も計画している．
|
