2016 Fiscal Year Research-status Report
合理的デザインによる高感度バイオ分子間相互作用検出用クッションタンパク質の創製
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15K06582
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
今中 洋行 岡山大学, 自然科学研究科, 助教 (10379711)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオ分子 / 固定化 / 相互作用 / タンパク質 / ペプチド / リガンド / 超好熱菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
固体基材上においてバイオ分子間相互作用の高感度検出を可能とする簡便・迅速な測定システムの確立を目指し，研究を進めた．固体表面親和性ペプチドに加え，足場としてのクッションタンパク質CutA1を利用した，新しいアイデアに基づいたリガンド分子固定化法の検討を行った．平成２８年度はリガンド分子をタンパク質，その中でもVHH抗体とした．VHH抗体のクッションタンパク質CutA1への挿入・連結が発現タンパク質の構造安定性に及ぼす影響ならびに，発現デザイナータンパク質固定化後の相互作用検出感度について調査した．その結果，CutA1とほぼ同程度の分子量のVHH抗体であってもCutA1中に束縛しつつ挿入することが可能であることがわかった．また，束縛することによりVHH抗体の耐熱性が向上することを明らかにできた．さらに，CutA1，固体表面親和性ペプチドおよび分子認識素子としてのタンパク質を用いた分子デザインを通じ，リガンド分子の固定化密度や配向性，空間配置などを制御することにより，Enzyme-Linked Assayや水晶振動子マイクロバランス法による相互作用検出において，最適な相互作用検出感度を示しうる分子の合理的な設計が可能であることがわかった．一方で，新規に金ナノ粒子親和性ペプチドを見出し，金ナノ粒子へのリガンド分子のワンンステップ修飾および高感度相互作用検出系に適用できることを示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超好熱菌由来のモデルクッションタンパク質であり，高度な構造安定性を有するCutA1を足場として多様な分子デザインを施し，発現させた各種デザイナーキメラタンパク質の構造安定性ならびに相互作用検出を評価した．その結果，足場タンパク質への挿入あるいは連結によっても安定性が維持されうること，リガンド分子の連結様式により，固定化後の相互作用検出感度が影響されることがわかった． また，金ナノ粒子親和性ペプチドを新たに見出し，これを用いた金ナノ粒子へのリガンド分子のワンンステップ修飾が可能であること，感度のよい相互作用検出に利用できることを明らかにできた．これら当初予定していた研究について，特に遅れはなく，順調に進展している.
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| Strategy for Future Research Activity |
バイオ分子間相互作用検出の詳細な比較と汎用性の担保が可能となるシステムを確立すべく，CutA1をクッションタンパク質・足場として用い，表面親和性ペプチドを連結した形の分子の固定化特性および固定化後の構造維持に関する詳細な解析を行う.リガンドペプチドやタンパク質の挿入，連結によっても構造変化が特に見られなかったこと，ならびにCoiled-coil構造などのドメイン導入でも構造安定性に特に問題が生じなかったことをふまえ，より大きなバイオ分子の挿入可能性について検討を進め，多様なバイオ分子間相互作用の検出への本技術の適用を目指す．また，金ナノ粒子を固定化基材として用い，親和性ペプチドを介したバイオ分子固定化による機能化が可能であることがわかったことから，相互作用検出高感度化にむけたクッションタンパク質の適用，検出に及ぼす物理化学的要素についても詳細に検討する．これらを通じて超高感度バイオ分子間相互作用検出システムの開発を進めるとともに，クッションタンパク質の実用化可能性について総括する.
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| Causes of Carryover |
消耗品の購入についてわずかに見直しを行ったため，未執行額が生じた
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
設備備品の購入は予定せず，主に消耗品の購入への使用を予定している．内訳としては，試薬類，プラスチック器具類を想定している．
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Research Products
(8 results)
