2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K06583
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
岡村 好子 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (80405513)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | メタゲノム / モジュール型酵素 / 特異的ゲノム増幅 / 全ゲノムシークエンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗菌、抗腫瘍、抗炎症、抗アミロイド作用、免疫抑制剤などを産生するリボソーム非依存型ペプチド合成酵素 (NRPS)やポリケチド合成酵素(PKS)は重要な創薬シーズであるが、1 つのタンパク質の中に複数のモジュールが並び、各モジュールはさらに複数のドメインからなるモジュール型酵素であり、巨大遺伝子クラスターにコードされていることから、通常のメタゲノム解析では遺伝子分離が不可能である。未知・難培養性微生物であるがゆえに入手することを諦めてきた新規モジュール型酵素を取得するために、本研究では未知・難培養性微生物のモジュール型酵素合成遺伝子の全長を取得し、その全配列をマイニングすることで、完全in vitro 合成法の道を拓くことを目的としている。
27年度は、モデル細菌Pseudomonas fluorescens ATCC17400 株のNRPS遺伝子をプライミングサイトとして特異的に全ゲノム増幅を行い、生じた１本鎖を２本鎖化することを目的とした。また、反応調製時の実験空間をISOクラス１の清浄度で行うことが必要であること、また、通常のクリーンベンチでは実験者由来のヒトDNAがコンタミネーションすることを配列解析から明らかにした。これらの知見を踏まえて、ISOクラス１のスーパークリーンゾーン生成装置において、2本鎖化することによって、コンタミネーションフリーの信頼性の高いDNA合成を達成した。
28年度は ATCC17400 株の特異的全ゲノム増幅後、２本鎖化した合成ゲノムを、次世代シークエンサーで解析し、２本鎖合成された増幅領域のカバレッジを評価した。また、ゲノムを断片化して、自己環化させ、特異的プライマーで1本鎖合成を試みた。全ゲノム領域の結果と反して、環状DNAのサイズが小さくなると、合成効率が減少することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者のもつ遺伝子特異的全ゲノム増幅法は、単菌分離を必要とせず、混合微生物系の中でも、標的細菌のゲノムのみを増幅することが可能である。
基本技術はΦ29 DNA ポリメラーゼを用いている点であるが、投入するプライマーは１本のため、１本鎖DNAが生じる。そこで、ランダムプライマーを用いて2本鎖化に成功した。
次に、PacBio次世代シークエンサーで解読することにより、リードのカバレッジを評価したところ、2本鎖の合成量と相関しないカバレッジであった。シークエンスケミストリーでは、20kbに断片化後、末端にループプライマーを連結して環状化する手順であるが、サンプル中の残存1本鎖が断片化効率およびライゲーション効率を阻害することがわかった。
また、ゲノムを断片化して、自己環化させることで、ターゲット領域を縮小化した環状ゲノムで同様の実験を行った。ターゲット領域を縮小化することで、より高効率に増幅されることを期待したが、予想に反して、合成効率が減少した。蛍光プローブを用いて直接観察した結果、特異的プライミング効率が減少することが原因であることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
縮小化した環状ゲノムより全ゲノムの方が増幅効率が良いことを考慮すると、方針を変更するべきと考え、混合微生物系の中から、標的細菌のゲノムのみを標識し、1細胞採取後に全ゲノムを増幅するシングセルゲノミクスで、未知モジュール型酵素合成遺伝子の全長を取得する方針に変更する。現在、モデル系でGFP発現大腸菌のmRNAをin vitroでプロ-ビングしてシグナル増感する方法を確立した(出願済み)。これをin situでプロ-ビング・蛍光標識することで1細胞採取し、1細胞ゲノム解析する。そして、未知モジュール型酵素遺伝子のオペロン全配列をマイニングして、in vitro cloningするところまでを目標とする。
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