2015 Fiscal Year Research-status Report
難生産性蛋白質分泌発現系のリバースエンジニアリング
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15K06585
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
河原崎 泰昌 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (80303585)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 難生産性蛋白質 / 組換え酵母 / 菌体密度 / 遺伝子発現 / 分泌蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高密度系でのみ生産が可能なラッカーゼをモデル組換え酵素として用い、種々の解析および工学的検討を行った。ホスト因子同定のため、網羅的転写産物解析により絞り込んだ候補遺伝子を選定した。広域転写因子ならびにその下流の転写因子群が候補に挙がっている。これらの遺伝子を欠失した酵母宿主株をそれぞれ作製し、菌体高密度化に伴う遺伝子発現量の変動を解析している（計画1、2）。この目的を達成するため、本予算措置で購入予定であったリアルタイムPCR装置を別予算で導入し、さらに本予算措置で導入したHPLCシステムを活用し解析を勧めている。一方、ゲスト因子同定のため、モデル酵素遺伝子にランダム変異を導入し、分泌ストレス低減型変異体の取得を試みている（計画3）。同定されたホスト因子、またはAdr1の恒常発現株を作成し、モデル酵素の発現特性を解析する（計画4、平成28年度着手予定）。野生型酵母株を変異原処理し、モデル酵素を生育連動的に発現する変異株を取得する（計画5）。取得できた菌株を用い、組換え酵素生産プロセスの最適化を行う（計画6、平成28年度着手予定）。これらを連携研究者とともに推進する。
本研究で得られた研究成果の一部を学会で発表した（鈴木ら、日本生物学会平成27年度大会、（鹿児島））。また関連した別の研究課題で得られた成果についても学会で公表した（河原崎ら、日本農芸化学会平成28年度大会（札幌））。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
難生産性蛋白質の発現を容易化している責任遺伝子の候補は、小胞体シャペロンやゴルジ体蛋白質など、蛋白質の分泌生産に直接関与しているものではないため、容易化機構の推定は容易ではない。繰り返し解析結果を吟味し、実験間誤差による遺伝子発現の変動を排除しており、時間を要している。
活性型組換え蛋白質生産量を最大化するゲスト因子について進化工学的な手法を用いて解析をすすめており、これについては新規な知見が得られている。特に、コドン使用頻度の偏りと蛋白質生産量との関連について研究が進み、この点において当初予定を超える研究成果が得られつつある。
新たな発現制御系を用いた難生産性蛋白質発現系の構築に着手し、新たな発現プロモーターによる発現誘導システムを当初予定よりも早く構築できた。
以上より、宿主因子の解析はやや困難に直面しているものの、研究全体としては順調に進行しているものと判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度以降は、以下のような予定で研究を進める（当初予定どおり）。
（計画1）網羅的転写産物解析・遺伝学的解析によるホスト因子同定（継続）：Adr1p下流遺伝子等、各遺伝子欠損株を調製し、生育速度およびモデル酵素生産能を比較する（継続）。必要に応じ、ホスト因子欠損株（必須遺伝子等の理由により欠損できない場合はAdr1欠損株等）の高菌体密度時の転写産物の網羅的解析を行い、野性株と比較する。計画6の進捗状況に応じ、高密度系誘導48時間後以降の生産速度の低下について、ホスト因子との関連性を調べる。
（計画2）ホスト因子候補群の発現変動の定量的解析（継続）：平成27年度に引き続き、菌体密度に応答する遺伝子群を同定し、発現量の経時変化をリアルタイムPCRにより調べる。
（計画4）ホスト因子候補の恒常発現株の作成と性質決定：計画1および2の実験結果をふまえ、同定されたホスト因子を多コピープラスミドにクローニングし、ホスト因子を構成的高発現する宿主株を作成する。モデル酵素の生産性を評価し、優良株（分泌ストレス緩和型宿主株）については計画1の要領で転写産物を網羅的に解析する。
（計画6）生産プロセス最適化：計画4および5により分泌ストレス緩和型宿主株が創成できた場合、その緩和の度合いに応じた最適誘導条件をフラスコスケールで検討する。蛋白質発現誘導に用いるプロモーターを現行のガラクトース誘導性プロモーター（PGal1）から銅イオン誘導性プロモーター（PCup1）に変更し、任意の宿主生育段階において、集菌および培地交換無しに発現誘導がかけられる系を構築する（平成27年度実施済）。
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