2015 Fiscal Year Research-status Report
キトサン系バイオ凝集剤生産機構の解明と代謝工学的手法を用いたその高生産化
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15K06586
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
武尾 正弘 兵庫県立大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40236443)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | キトサン / Citrobacter / 凝集剤 / 代謝工学 / 膜濃縮 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、キトサン系バイオ凝集剤の生産機構の解明と代謝工学的手法を用いた凝集剤の高生産化を目的に、バイオ凝集剤生産菌であるCitrobacter属細菌の推定凝集剤生合成経路とドラフトゲノム解析結果から、(1)凝集剤の多糖化と膜分泌に関わるbfpABCD遺伝子群とその産物の機能解析及び(2)遺伝子破壊あるいは遺伝子導入による凝集剤の高生産化を試み、また、実生産を考慮して(3)培養液からの凝集剤の膜濃縮・回収プロセスを検討した。
まず、凝集剤高生産菌株であるC.freundii IFO13545株のbfpABCD遺伝子群の各遺伝子を相同組換え法で破壊したところ、いずれの破壊株も完全に培養液の凝集活性を失った。このことからこの遺伝子群が凝集剤生産に必須であることがわかった。次に、本菌株からbfpABCDあるいは多糖化に関わると推定されるbfpCをクローン化することに成功した。この際、この遺伝子群をIFO13545株に導入した場合、生存できなくなることがわかったため、導入遺伝子の発現制御が必要ではないかと考えられた。一方、bfpCの遺伝子産物の活性測定のため、その産物であるキトサン様多糖を迅速かつ多検体測定できる分析系の開発を試み、高感度にキトサンや凝集剤を測定できるELISA法が開発できた。
また、アミノ糖の生合成に関わるヘキソサミン経路の遺伝子強化を狙い、glmUS及びglmMをIFO13545株の別の遺伝子座から個別にクローン化し、glmUSMとして再構築してIFO13545株へ戻したところ、ベクターコントロールの菌株に比べ約5倍の凝集活性を示し、遺伝子導入の効果が見られた。
さらに、IFO13545株の培養上清を用い、小スケールで各種材質・分画分子量のUF膜の中空糸膜モジュールで凝集剤の濃縮を試み、凝集活性のロスがほとんどなく凝集剤を濃縮できる中空糸膜を決定できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
凝集剤の多糖化と膜分泌の機能の解析に関する研究では、その候補遺伝子の遺伝子破壊による重要性の証明、今後の解析に必要なクローン化に成功している。その中でbpfCにコードされるグリコシルトランスフェラーゼの機能解析では、合成される多糖を検出する必要があり、そのためにバイオ凝集剤に対するポリクローナル抗体とレクチンを用いたサンドイッチELISA法を検討し、これを確立できた。従って、H28以降の機能解析に関する研究の準備がある程度整った。
また、アミノ糖の生合成に関わるヘキソサミン経路の遺伝子群glmUSMを野生株に追加で導入し、凝集活性の改善に成功したことにより、具体的に活性の高い菌株の育種の一例を示すことができた。
さらに、凝集剤の膜濃縮・回収プロセスについては、小スケールであるが、それに適した中空糸膜モジュールの材質、分画分子量を決定することができ、H28以降のスケールアップのための基礎情報が得られた。
以上の結果から、おおむね順調に進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
凝集剤の多糖化と膜分泌の機能の解析に関する研究では、H27にbfpCのクローン化に成功しているので、目的タンパクのタンパク発現とカラム精製を行い、その精製タンパクを用いて活性の測定に取り組む。活性測定では、基質となるUDP化アミノ糖からオリゴ糖もしくは多糖が生産できた場合、これを確立したELISA法にて検出する。
また、代謝工学を用いた凝集剤の高生産化の研究では、glmUSMの遺伝子導入に加え、凝集剤の生合成経路の炭素代謝の逆流を防ぐ、いくつかの遺伝子破壊株の構築を試みる。さらにグルコースからの凝集剤生産につながる遺伝子破壊も実施する。
一方、凝集剤の膜濃縮・回収プロセスについては、30L培養槽を用いた大量培養と10L規模の培養液から、MF膜による菌体除去とUF膜による凝集剤の濃縮を実施する。
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| Causes of Carryover |
必要購入物品を３月期までに購入後、端数として739円が残ったが、特に急ぎ必要な費用が発生しなかったために残した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
必要物品の購入に併せて使用する。
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