2016 Fiscal Year Research-status Report
シナプスレベルでのRgk1機能解析による記憶成分特異的神経子機構の解明
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15K06700
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
村上 智史 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (10463902)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 記憶維持 / Rgk1 / ショウジョウバエ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一部ドメインを欠いたRgk1配列にGFPを付加したコンストラクトを用いて、各ドメインがシナプスレベルでのRgk1の局在にどの様に働くのかを調べた。具体的には、Brp抗体で可視化したシナプスに対してGFP融合コンストラクトのシグナルがどの様に局在するのかを調べた。その結果、N末部位にあるドメインを欠いたRgk1は、野生型Rgk1で見られる様な凝集体が見られないことがわかった。次に、その凝集体がどこに局在するのかを、NMDARやDrep-2などのポストシナプスマーカーを用いて調べたところ、凝集体はポストシナプスには存在せず、プレシナプスのactive zoneに隣接した領域（peri-active zone）に局在する可能性が示唆された。
これまでに、過剰発現させたRgk1によってRac依存的な忘却が抑制されることを示唆するデータが得られていた。そこで、内在的なRgk1が野生型において同様の働きを持つかどうかを調べるために、Racを恒常活性化させた個体で内在rgk1レベルを落とす実験を行った。その結果、内在rgk１レベルを下げるとRac恒常活性による影響がさらに強く見られるようになった。したがって、Rgk1はRac依存的な忘却を抑えることにより、記憶の維持に働いていると考えられた。
これまでの成果から、rgk1がanesthesia-sensitive memoryとanesthesia-resistant memoryの両方を制御している可能性が示唆されている。そこで、それぞれのmemory componentに特異的に働くことが知られているrutabagaとdunce遺伝子の変異体を用いて、rgk1が記憶を制御する分子機構に属するかどうかを調べた。その結果、cold shock後の記憶において、rgk1変異体のスコアが、rutabagaとdunceの中間程度の値を示した。したがって、rgk1はこれら既知の経路とは独立に記憶を制御している可能性が示唆された。
Rgk1の解析から得られた結果を論文としてまとめ、Journal of Neuroscience誌に投稿し、受理された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
論文という形でこれまでの研究をまとめることができた。また、Rgk1のシナプスレベルでの局在とその制御について、一定の成果を上げることができた。さらに、RacとRgk1との関連を裏付けるデータを得ることができ、Rgk1が属する分子機構について理解を深めることができた。一方で、Rgk1のシナプスにおける局在については、論文に含められる様な確かなデータを得ることができず、今後さらなる解析を必要とすることになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
もともとRgk1は記憶依存的に変動する遺伝子の一つとして得られてきた。Rgk1の哺乳類ホモログではその発現がMAPK経路によって制御されているという知見があるため、Rasトランスジーンを用いた実験系を用いることによって、rgk1に置いてもその様な制御が見られるのかを調べる。
これまでrgk1について実験により明らかになったことと、Rgk1の哺乳類ホモログにおける知見から、Rgk1がRac/Pak/LIMK/Cofilin経路で働いている可能性が出てきた。そこで、この経路に属する遺伝子との相互作用を調べることにより、実際の分子機構を明らかにする。
Rac依存的な忘却について、 キノコ体に投射するDopamine神経の一部が関わっているという報告があり、Rgk1がこれらの神経細胞とどの様に関わるのかを、抗体染色実験や、double knockdown実験などを行うことにより明らかにする。
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| Causes of Carryover |
今年度を通して論文執筆を行っていたため、予定していたシナプスレベルでの解析や、キノコ体入力神経細胞の解析を行うことができなくなり、次年度に行うこととした。racとrgk1との相互作用を裏付けるデータが取れたことにより、分子機構に関する解析をさらに進めることにした。また、国際学会での発表を予定していたが論文執筆やrevision対応があったため、次年度に行うことにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
シナプスレベルでのRgk1の局在解析のために使用する新しいコンストラクトの作成費用、キノコ体入力神経細胞解析のための系統取得費用・免疫染色実験のための費用、Rgk1とLIMK,Rho kinaseなどとの相互作用を調べるための生化学実験系のための費用として使用する。さらにこれらに伴う系統維持のための費用として使用する。また、海外で行われる国際学会において論文で発表したデータを含む知見を発表するための旅費として使用する。
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