2016 Fiscal Year Research-status Report
mTORシグナル活性化マウスによる神経機能の解析および疾患モデルの確立
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15K06701
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
葛西 秀俊 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (40403232)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | mTOR / マウス / 小脳 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに小脳プルキンエ細胞特異的に活性化型mTORを発現するトランスジェニックマウス（以下、L7-mTOR Tgマウス）の作製を行い、プルキンエ細胞の肥大化およびアポトーシスが引き起こされることを明らかにした。さらに行動解析によって、L7-mTOR Tgマウスは運動機能が障害されていることが明らかとなった。
今年度は、これらの表現型を引き起こした原因を明らかにするために、以下の解析を行った。まず、L7-mTOR Tgマウスにラパマイシンの投与を行ったところ、プルキンエ細胞の肥大化およびアポトーシスが抑制された。次に、アポトーシスの原因として神経細胞への様々なストレスに着目し、各種のマーカー抗体を用いた免疫組織染色を行った。その結果、L7-mTOR Tgマウスのプルキンエ細胞において、低酸素ストレスマーカーのHIF1alphaおよびその下流分子であるhemeoxygenase-1の強い陽性シグナルが観察された。これらのプルキンエ細胞は、アポトーシスマーカーであるCleaved caspase 3陽性であった。以上の結果より、プルキンエ細胞におけるmTORC1シグナルの活性化は、低酸素ストレスを介して細胞死を引き起こされていることが示唆された。
さらに、子宮内エレクトロポレーション法のセットアップを試みた。胎生12.5日齢の胎仔の第4脳室にEGFPを発現するプラスミドDNAを注入し、電圧をかけることによってプルキンエ細胞の前駆細胞にEGFP遺伝子の導入を行った。生後2週齢において小脳切片の観察を行ったところ、一部のプルキンエ細胞においてEGFPのシグナルを確認することができた。今後、mTOR関連タンパク質の遺伝子導入を行うことによって、より詳細に細胞の肥大化やアポトーシスの分子メカニズムを明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は目標としていた表現型の分子メカニズム解析に着手し、低酸素ストレスがアポトーシスに関連していることを示唆するデータを得ることができた。子宮内のエレクトロポレーションについてはmTOR下流分子の遺伝子導入を計画していたが、プルキンエ細胞へのエレクトロポレーションは脳発生の初期に行う必要があり、技術的に非常にハードルが高かった。様々な工夫を行うことによって、安定的に遺伝子導入個体を得ることができるようになった点において順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に子宮内エレクトロポレーションのセットアップおよび遺伝子導入の効率化を行うことができたため、次年度は様々な分子の遺伝子導入を計画している。まず、mTORC1シグナルの下流分子や低酸素ストレス関連分子の過剰発現あるいはノックダウン実験によって、アポトーシスや細胞の肥大化といった異なる表現型がどのような分子メカニズムによって引き起こされているのかを明らかにする。また、既に大脳皮質で活性化型mTORを発現するTgマウスを用いて、mTOR相互作用分子のプロテオミクス解析を行っており、mTORの新規相互作用分子が得られている。この分子についても子宮内エレクトロポレーション法を用いて、小脳機能およびmTORシグナルにおける役割を解析していく方針である。これらの実験を行うことによって、細胞の肥大化やアポトーシスの分子メカニズムをより詳細に明らかにすることを試みる。
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| Causes of Carryover |
本年度は、子宮内エレクトロポレーションのセットアップを行ったが、技術的に非常にハードルの高い実験であったため、mTORおよびHIF1シグナル関連分子の遺伝子導入が次年度にずれ込んだため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
mTORmTORおよびHIF1シグナル関連分子の過剰発現およびノックダウンコンストラクトを作製するための実験試薬および遺伝子導入器具を購入する。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Use of human methylation arrays for epigenome research in the common marmoset (Callithrix jacchus).2017
Author(s)
Ueda J, Murata Y, Bundo M, Oh-Nishi A, Kassai H, Ikegame T, Zhao Z, Jinde S, Aiba A, Suhara T, Kasai K, Kato T, Iwamoto K
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Journal Title
Neurosci Res.
Volume: 120
Pages: 60-65
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Dephosphorylated parafibromin is a transcriptional coactivator of the Wnt/Hedgehog/Notch pathways.2016
Author(s)
Kikuchi I, Takahashi-Kanemitsu A, Sakiyama N, Tang C, Tang PJ, Noda S, Nakao K, Kassai H, Sato T, Aiba A, Hatakeyama M.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 7
Pages: 12887
DOI
Peer Reviewed
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