成体脳ニューロン新生の分子制御機構解明とその応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06711
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 下崎 康治 長崎大学, 先導生命科学研究支援センター, 助教 (40379540)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 神経科学 / 神経幹細胞 / ニューロン新生 / 未分化維持機構 / 自己複製機構 / エピジェネティクス / 転写因子

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究のきっかけとなったDNA脱メチル化因子TET1による分子制御ネットワークにおけるRev-erb遺伝子の位置づけと制御遺伝子の背景を整理するために、TET1遺伝子ノックダウン神経幹細胞のDNAマイクロアレイ解析から得られた結果の遺伝子量を定量PCRにて実測定した。さらにFACSを用いてDNA解析を行ったところ、ノックダウン神経幹細胞では細胞周期への影響が顕著に観察された。現在その研究報告をまとめている段階である。また成体脳の神経幹細胞におけるRev-erb遺伝子の機能を明らかにするために、Rev-erb遺伝子に対するshRNA発現ノックダウンベクターをレンチウィルスベクターシステムにて構築した。さらにこのshRNA発現ウィルスベクターのタイターを測定し、濃縮ベクターを成体マウス脳の海馬領域にステレオタキシス・マイクロインジェクション法にて注入接種した。この接種マウスにBrdUを投与飼育し、パラフォルムアルデヒド固定の後に海馬領域を免疫染色法にて解析した。このノックダウンベクターはEGFPを発現するため、感染した細胞は緑色に検出される。in vivoにおけるRev-erb遺伝子のノックダウン解析はNestin、BLBP、DCX、NeuNなどのマーカー遺伝子に対する抗体との共染色による細胞形態観察とBrdU取り込み率の測定を行った。その結果、Rev-erb遺伝子のノックダウンでは古・新生どちらのニューロンの形態にも明白な変化は観察されなかったが、BrdU取り込み率がノックダウンサンプルでは減少している傾向が得られた。現在さらにサンプル数を増やして統計的に有為な結果を確定させるべく実験を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究申請書の平成２７年度研究計画におおむね沿って研究を行い、その結果を得ている。

Strategy for Future Research Activity

神経幹細胞と新生ニューロンにおけるRev-erb遺伝子機能のより詳細なin vivoのデータを得るために、Rev-erb遺伝子に対するドミナントネガティブ体の発現ベクターを作製する。単一の神経幹細胞と新生ニューロン解析のために、レトロウィルスタイプの発現ベクターを用いる。このウィルスベクターを成体マウス脳海馬領域に注入接種し、免疫染色法を用いて機能解析を行う。さらに計画書に記載の通り、Rev-erbのリガンド化合物を成体マウスに投与し、新生ニューロンへの影響とストレス応答における機能解析を行う。

Causes of Carryover

申請者所属施設の機器配置改変に伴い設置場所が再検討されたことにより、本年度購入予定であった動物２次元行動解析システム一式の購入を延期したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究計画書記載の設備備品の購入、研究消耗品、研究活動に付随する経費、及び人件費として使用する。