ショウジョウバエ変性空胞形成・修復へのグリア細胞の関与と分子基盤

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06718
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 加藤 健太郎 杏林大学, 医学部, 講師 (30733068)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 損傷応答 / グリア細胞 / 中枢神経 / ショウジョウバエ

Outline of Annual Research Achievements

中枢神経系は損傷を受けると様々な細胞応答を示す。変性空胞の形成はそのうちの一つであるが、その形成と修復には不明な点か多い。本研究は、この変性空胞の形成・修復における細胞の動態、背景にある分子基盤の解明を目的とし、ショウジョウバエをモデルとして、特にグリア細胞の役割に着目して解析を行っている。昨年度までに、変性空胞の形成過程、関与するグリアサブタイプの同定と、損傷時における同グリア細胞の特定の神経繊維への関わりと関連分子の一部について明らかにした。
本年度は、空砲形成と、損傷時において特定の神経線維の維持に関与するグリア細胞からの因子をノンバイアスに探索するために、RNAシークエンスによる発現解析を行った。標的グリアサブタイプの過剰・機能更新した試料、機能低下した試料、対照試料、これらにさらに損傷の有無を組み合わせた試料について、中枢神経系での発現RNAのシークエンスを得た。それぞれの試料の比較において大きく発現量の増加、または減少した遺伝子を候補遺伝子とした。特定のグリアサブタイプの遺伝子操作のうえ、中枢神経系全体における発現解析にも関わらず、これにより得られた候補関連遺伝子リストには、ショウジョウバエにおける既知の損傷応答関連遺伝子も含まれており、解析方法の妥当性が示唆されている。得られた候補遺伝子リストを元に、標的グリアサブタイプ特異的に各遺伝子の発現量をRNAiにより下げ、空砲形成と特定の神経線維への影響の解析を現在まで継続して行っている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

空砲形成と神経応答に関わる因子のノンバイアスな探索のために、サブタイプ特異的なRNAシークエンスを行う計画であったが、標的グリアサブタイプから十分な量と質のRNAを精製することができなかった。そこで、計画を一部変更し、標的サブタイプを遺伝子操作した上で中枢神経系全体からRNAを精製する手法をとった。これらの事情により、一昨年度から全体的な進行に遅れが生じた。現在、シークエンスは完了し、関連候補遺伝子のリストを得て、解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

計画に従って、候補遺伝子の関与の解析を進める。この解析では、標的グリアサブタイプにてRNAiによって候補遺伝子の発現を低下させ、その関与を検討する。細胞自律的・非自律的に関わらず、グリア細胞と神経系のそれぞれへの影響を検討する。損傷一定時間後に試料を固定し、あらかじめGFPやRFP等で蛍光標識してるグリアサブタイプや神経要素を指標とする。表現型が確認されたものについてはタイムラプス解析を行う。

Causes of Carryover

発現解析に遅れにより、全体の進行が遅れたため。発現解析にて困難が生じ計画の変更を行ったが、その後の解析は研究計画にある通りに行う。昨年度までに使用していなかった費用は、試薬・RNAiショウジョウバエ系統の購入等、これらの解析に使用する。