2017 Fiscal Year Research-status Report
シナプス間隙マトリックスによるコンパートメント形成とシナプス分化機構
| Project/Area Number |
15K06721
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
|---|
Principal Investigator |
浜 千尋 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (50238052)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 実 東邦大学, 理学部, 博士研究員 (40449236) [Withdrawn]
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | シナプス間隙 / マトリックス / Hig / Hasp / ショウジョウバエ / アセチルコリン受容体 / サプレッサー遺伝子 / てんかん |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
当研究室では、中枢シナプスのシナプス間隙を構成するマトリックスタンパク質であるHigを同定し、そのHigがコリン作動性シナプスの間隙に局在してアセチルコリン受容体(nAChR)の集積を制御していることを明らかにした。シナプスは神経伝達装置として神経科学の重要な研究課題であるが、シナプス間隙を構成する因子やその機能については、未だにわずかな知見しか得られていない。また、ヒトにおいては、Higと類似したタンパク質の異常が「てんかん」を発症させることが報告されているが、その発症機構は不明である。本研究では、Higと新たに同定されたHaspの解析を基に、いかにシナプス間隙マトリックスが構築され、シナプスの分化を制御するのか、その普遍的な機構を分子レベルで明らかにすることを目的とした。本研究の成果は以下の通りである。
（１）HigおよびHaspと相互作用するシナプスタンパク質の同定：免疫沈降実験により、Haspと相互作用するタンパク質としてNrx-1およびCG42613を同定した。さらに、CG42613の変異の分離・解析により、CG42613はHaspの局在化を制御していることが判明した。加えて、RNAiスクリーニングにより、HigおよびHaspの局在化を制御する候補因子として複数の膜タンパク質の同定にも成功した。
（２）higのサプレッサー遺伝子の同定：higと相互作用する遺伝子の同定を多角的に試みており、その一環としてhig変異の活動性および寿命の低下を抑えるサプレッサー変異の同定を行った。その結果、独立に２種の変異を分離し、いずれもnAChRサブユニットDa5遺伝子の異なるアミノ酸に生じた置換変異であった。すなわち、hig変異体においては、Da5タンパク質は生存上、有害な物質として存在する。様々な解析を基に、中枢におけるnAChRの集積機構モデルの構築を試みている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画していた、HigおよびHaspと相互作用を示すシナプスタンパク質の同定、およびHaspのシナプス間隙局在化機構については、具体的な因子が複数同定され、その中にはCG42613のように実際に遺伝的にHaspの局在を制御していることを示す証拠が得られたものもある。従って、これらの計画項目はおおむね順調に進んでいると言える。一方、Higと熱ストレスとの関連性の解析、およびシナプス間隙におけるコンパートメント形成とシナプス構造の統合的編成については、十分に進展しているとは言えない。特に後者については、何度か試みた抗体作製が難航していることが一つの原因となっている。もう一つの原因は、これらの計画以外の優先順位の高い新しい項目に着手したことによる。すなわち、Higによるアセチルコリン受容体(nAChR)の集積制御機構についてである。この研究では、hig変異のサプレッサー変異の同定を基に、HigがnAChRサブユニットDa5と選択的相互作用をし、一方Da5は他のサブユニットとは異なりnAChRの集積において中心的な役割を示すことが明らかとなってきた。nAChRの集積機構は、神経筋接合では歴史的にも詳しく解析されてきたが、中枢シナプスにおける知見はほとんどない状態であり、本研究のシナプス間隙マトリックスタンパク質とnAChRの相互作用についての成果が神経機能の基礎的メカニズムの解明につながる可能性がある。従って、限られた戦力の中で、よりエキサイティングな内容の研究項目に高い優先順位をつけて研究を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策は以下の通りである。
（１）HigおよびHaspと相互作用するシナプスタンパク質の同定：同定されたシナプスタンパク質をコードする遺伝子の変異体を作成してHig、Haspを含めたシナプスタンパク質の局在を解析する。それとともに各タンパク質に対する抗体を作成し、それぞれの局在を種々の変異体で解析し、シナプスあるいはシナプス間隙におけるインタラクトーム解析を進め、シナプス間隙を含むシナプス構造の構築機構を解明していく。さらに、シナプス間隙にはHigとHaspがそれぞれ構築するナノコンパートメントが存在しており、これらのコンパートメンの構築機構についても種々の遺伝子変異を導入し、超解像顕微鏡を用いながら明らかにしていく。
（２）中枢シナプスでのシナプス間隙タンパク質HigによるnAChRの集積機構：まず、何故、Da5変異がhig変異をサプレスするのかを突き止める必要がある。そこには、Da5タンパク質がnAChRの他のサブユニットタンパク質と異なる性質を持つことに原因がある可能性がある。そこで、解析結果の解釈をより容易にするため、Da5の機能を完全に失った変異をCRISPR/Cas9法により分離し、その変異を今後の解析に用いて行く。その上で、higおよびhigDa5二重変異においてnAChRの他のサブユニットの局在を解析する。また、制御メカニズムの中にエンドサイトシスが関与するという視点で、エンドサイトシスを制御するdynaminをコードするshibire遺伝子の温度感受性変異を用いて解析を進めるとともに、Rab5などのエンドサイトシスマーカーを導入して解析する。
|
| Causes of Carryover |
本研究を完成させるためには、本研究で同定された複数の新たなシナプスタンパク質の局在を明らかにすることが必要である。そのために、それぞれの抗体を作成し解析を試みてきているが、抗体の特異性に問題があり、今後の解析に十分でないことが判明してきている。そこで、抗原部位を変える、あるいは抗血清作成の宿主を変え、新たな抗体作成を計画している。平成30年度には、作成された抗体を用いた解析のための費用として助成金を使用する予定である。
|
