2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K06764
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| Research Institution | Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center |
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Principal Investigator |
鈴木 康予 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 遺伝学部, 研究員 (60416188)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | α-synuclein / パーキンソン病 / リソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
α-synucleinは140個のアミノ酸からなる可溶性タンパク質である。しかし、シヌクレイノパシーと呼ばれる一群の神経変性疾患では、本タンパク質を主成分とする不溶性の凝集体が形成され、神経細胞内やグリア細胞内に蓄積する。本研究では、神経細胞内でα-synucleinが蓄積する分子機構を、α-synucleinの２つの分解系（リソソーム・オートファジーとユビキチン・プロテアソーム）から明らかにし、シヌクレイノパシーの病因解明を目指している。近年の研究によって、リソソーム病のひとつであるゴーシェ病の原因遺伝子であるβ-グルコセレブロシダーゼ遺伝子の変異がパーキンソン病の危険因子であることが明らかにされた。また、様々なリソソーム病において、中枢神経系にα-synucleinの蓄積が報告されている。したがって、リソソームの機能低下がα-synucleinの蓄積を引き起こすと考えられる。
本年度は以下の2点について重点的に解析を行った。１）昨年度の各種リソソーム酵素の活性阻害剤を用いた研究結果から、α-synucleinの不溶化にはカテプシンが強く影響を及ぼすことが明らかになった。今年度はα-synucleinの不溶化を引き起こすカテプシンのサブタイプを同定するためにカテプシンBとカテプシンDを標的としたsiRNAを設計した。α-synucleinを過剰発現するHEK293細胞にsiRNAを導入し、α-synucleinの不溶化を検討した。２）ゴーシェ病の原因遺伝子（GBA1）の産物であるβ-グルコセレブロシダーゼの酵素活性の低下がα-synucleinの蓄積に及ぼす影響を解析するために、GBA1に対するsiRNAを設計した。α-synucleinを過剰発現するHEK293細胞にsiRNAを導入し、二次元電気泳動のウエスタンブロット解析を行いα-synucleinの動態を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度はα-synucleinの蓄積について、１）関与するカテプシンのサブタイプの同定と２）ゴーシェ病の原因遺伝子（GBA1）の産物であるβ-グルコセレブロシダーゼの活性低下の影響を解析した。
１）カテプシンのサブタイプは、α-synucleinの蓄積への関与が多く報告されているBとDに対してそれぞれ 4～6 種類のsiRNA発現ベクターを設計し、最もよく抑制効率の高かったベクターをα-synucleinを過剰発現するHEK293細胞に導入した。得られた細胞をTriton X-100の可溶性によって分画し、不溶性画分を比較解析したところ、カテプシンDの発現抑制によってα-synucleinの不溶化が促進される傾向が見られた。しかし、同時に行った両カテプシンの解析では、いずれもタンパク質の高い安定性が確認され、一過性のsiRNA導入では抑制効果が十分に発揮できていないことが分かった。
２）GBA1に対するsiRNAを設計し、siRNA発現ベクターをα-synucleinを過剰発現するHEK293細胞に導入した。昨年度に行ったβ-グルコセレブロシダーゼに特異的な活性阻害剤を用いた解析では、Triton X-100不溶性画分でα-synuclein の変化は見られなかった。そこで、翻訳後修飾や複合体形成を解析するため、二次元電気泳動のウエスタンブロット解析を行った。Syn1抗体で検出したが、GBA1のsiRNAを導入したHEK293細胞ではα-synuclein の等電点や二次元目の移動度に変化が見られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も、引き続きα-synucleinの蓄積について、１）関与するカテプシンのサブタイプの同定と２）ゴーシェ病の原因遺伝子（GBA1）の産物であるβ-グルコセレブロシダーゼの活性低下の影響の解析を行う。
本年度の研究結果から、１）カテプシンのタンパク質量を減少させるために、siRNA安定発現株の樹立を目指す。カテプシンの量および活性が十分に低下した細胞株にα-synucleinを過剰発現させることによって、その不溶化への影響を詳細に検討する。２）β-グルコセレブロシダーゼの活性低下が及ぼすα-synucleinへの影響はHEK293細胞では検出できていない可能性がある。そこで、細胞を神経芽腫由来SH-SY5Y細胞などに変え、α-synucleinの不溶化について解析を行う。加えて、SH-SY5Y細胞などを分化誘導し、α-synucleinの凝集体形成への影響も観察する。
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| Causes of Carryover |
本年度の実験操作には研究協力者の必要がなく人件費が発生しなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
消耗品購入 82.2万円、国際会議及び国内学会発表にかかる旅費・参加費 20万円、研究成果発表費用（学会誌投稿料）15万円、論文複写費 4万円を計画している。
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