2015 Fiscal Year Research-status Report
脂質ラフトにおける神経極性決定シグナル伝達制御機構の解明
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15K06770
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
本多 敦子 新潟大学, 研究推進機構, 研究員 (40467072)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | M6a / 神経極性 / ラミニン / 細胞外基質 / シグナル伝達 / 脳発生 / パルミトイル化修飾 / テトラスパニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は『神経特異的糖タンパク質M6aにより形質膜上に形成されるタンパク質複合体』の神経極性決定における役割と発生脳におけるその重要性を明らかにし、さらに脂質ラフトにおけるM6aタンパク質複合体の局在化の分子機構とその生理的意義を解明することを目的とし、本年度は、以下の２つの課題を遂行した。
[1] M6aを介した分子間相互作用と、そのシグナル伝達による神経極性決定機構の解明
M6aと相互作用するラミニン受容体候補を同定し，ラミニン～受容体～M6aに至るまでの分子間相互作用を示した。マウス胎児脳脂質ラフト画分を用いて、M6a抗体による免疫沈降を行ない、M6aとの共沈タンパク質群に、B1インテグリンが含まれることをウェスタンブロットにより確認した。又、活性型B1インテグリンの特異的抗体を用いて細胞染色を行ない、ラミニン依存的に形質膜上に集積するM6aと活性型B1インテグリンの共局在を確認した。
[2] M6a複合体が制御するシグナル伝達制御の脳発生過程における役割の解明
① in utero遺伝子導入法により、マウス胎仔大脳皮質におけるM6aのノックダウン実験を行ない、発生過程の脳におけるM6aの重要性を示した。M6aノックダウン神経細胞は、大脳皮質の中間帯における極性決定が遅れ、多極性突起を持つ細胞が多く見られた。一方、神経前駆細胞からの神経細胞への分化については、顕著な異常は認められなかった。②in utero遺伝子導入法により、M6aノックアウトマウス(KO)胎児脳に、脂質ラフトに局在化しないパルミトイル化部位の変異M6aを導入し、発生過程の大脳皮質における形態変化を解析。パルミトイル化M6aの脂質ラフトでの分布の、大脳皮質形成における重要性を明らかにした。導入神経細胞は、極性形成が阻害されフィロポディアを過剰形成し、細胞移動や極性形成の阻害が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究開始時に本年度予定していた研究計画内容、[1] M6aを介した分子間相互作用と、そのシグナル伝達による神経極性決定機構の解明、及び、[2] M6a複合体が制御するシグナル伝達制御の脳発生過程における役割の解明についての解析を遂行し、期待した研究成果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、脂質ラフトにおけるM6aタンパク質複合体の局在化の分子機構とその生理的意義の解明を主な目的とし、以下の研究を行なう。
[1]M6a抗体結合ビーズにより、形質膜上におけるM6aの集積を誘導し、M6aの集積によるM6a相互作用タンパク質群や、脂質の局在性の変化を明らかにする。
①M6a抗体結合ビーズにより、形質膜上でのM6aの集積を誘導し、M6a集積によるM6a相互作用タンパク質の局在化や、膜領域の特異性を明らかにする。ポリスチレンビーズもしくは、金コロイド粒子に抗M6a抗体を結合させ，分散培養した神経細胞に添加する。GFP標識した各シグナル分子の過剰発現，もしくは，抗体染色により形質膜状の分子の分布とビーズの接着との関係を全反射顕微鏡，もしくは超解像度顕微鏡によりイメージング解析する。またM6aが集積する膜領域の特性を、脂質特異的蛍光プローブや標識抗体、脂質ラフト分子特異的マーカー(GFP-flotillin1等)を用いて明らかにする。
②M6a抗体結合ビーズによる形質膜上でのM6aの集積が、神経極性決定を誘導し、軸索形成を誘導するかどうかを明らかにする。 M6a抗体ビーズが結合し、M6aの集積することにより，神経極性決定が誘導されうるか、ビーズの結合した神経細胞の形態をタイムラプス解析することにより、M6a集積に伴う脂質ラフトにおけるシグナル伝達制御が、神経極性決定を制御することを明らかにする。
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Research Products
(3 results)
