2016 Fiscal Year Research-status Report
成長円錐伸展時の膜輸送を制御する３つのG蛋白質の時空間活性制御ネットワークの解析
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15K06782
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
中村 岳史 東京理科大学, 研究推進機構生命医科学研究所, 教授 (60362604)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞内シグナル伝達 / 神経突起伸展 / 小胞輸送 / G蛋白質 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
G蛋白質TC10は小胞の細胞膜への輸送を介して神経突起伸展に関わる。申請者は、神経成長因子による突起伸展の系を使い、「小胞上のTC10活性低下による繋留複合体の崩壊がその小胞の膜融合を開始する」というモデルを提案している。前年度の解析で、同様の機構は強力な軸索再生促進因子でもあるcAMPによる突起伸展でも働いているが、シグナル伝達経路が異なることがわかった。今年度はその解析を進めて、cAMPの下流でPKA-STEF-Rac1-p190Bという経路が働いてTC10のGTP加水分解と膜融合促進が起きることを明らかにした。また、軸索ガイダンスや損傷軸索の再生に関するTC10の働きを個体で調べるためにノックアウトマウスを作製した。このマウスを材料として運動神経軸索の損傷再生の検討を行い、TC10が軸索再生の促進に働いていることを示す結果を得た。このマウスの脳神経系には大きな構造異常は認められないが、TC10が高発現する一部の神経細胞で軸索走行異常が起きている可能性がある。
神経突起伸展時の膜制御においてRab11を含むマシナリーがどう働いているかを明らかにするためにRab11のFRETセンサーを開発している。現時点で最も高性能のセンサーを神経細胞株に発現させて突起を移動する小胞でのRab11活性を検討した。十分な例数ではないが、停止中の小胞上のRab11活性の方が移動中の小胞上の活性よりも高い可能性がある。この種の解析に繁用される優勢劣性型Rab11には方法上の問題があり、これを使用せずにRab11とリサイクリング小胞の輸送の関係を検討する実験系を構築した。その結果は先行研究とも今回の研究とも部分的に一致するものであり、Rab11だけでなく積み荷タンパク質や他のRabファミリーG蛋白質などが協調的に働いてリサイクリング小胞の輸送システム全体を制御していることが示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究対象である膜輸送を介して神経突起伸展を促進する３つのG蛋白質のうち、TC10について、生理的に重要なセカンドメッセンジャーであるcAMPからTC10の活性変化に至る新たな経路を同定できた。また、TC10の個体レベルの解析から、成体での神経軸索の形態制御などについて重要なアイデアが生まれる可能性があると考えている。Rab11についてはFRETセンサーを使って新たな知見を得ることができた。Rab35についてもセンサーを使っておおむね研究計画にそった解析を行って新たな知見を得ることができたが、イメージングの技術的な難点のため現時点ではそのデータの信頼性は十分ではない。総合して上記のように評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
TC10ノックアウトマウスでは、末梢神経での軸索再生が大きく損なわれる。中枢神経での軸索再生の誘導についての最近の知見を使って、TC10が中枢神経でも軸索損傷からの再生に働いているかどうかを検討する。また、TC10が高発現している神経組織の初代培養系を用いて、in vitroでの突起伸展能の変化を確認する。TC10が高発現する一部の神経細胞で起きている可能性がある軸索走行異常について、より明確な観察が可能な透明化試料の二光子顕微鏡による観察を行って、信頼できるデータを取得することを試みる。Rab11については、現時点で最も高性能のセンサーであっても必ずしも十分なダイナミックレンジが得られないため、データの信頼性を上げるためにRab11センサーの改良を図る。具体的には最近発表されたcpFRETシステムを利用して網羅的に試してみる。また、神経突起伸展時の小胞輸送制御や膜制御については、イメージングによる検討を行う系は立ち上がっているので、改良したセンサーでの実験を行うとともに、光操作などの手法で外部から働きかけたときの応答を検討する。Rab35については、共焦点顕微鏡を使った活性化イメージングの再現性を高める工夫をした上で、研究計画にそって解析を進める。
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| Causes of Carryover |
遺伝子組換えマウスを使った実験で、ほかの方向からの解析で結果が得られて、もともとの計画にあった実験の一部を行う必要性が低くなり、使用動物数を最低限にするという原則に従って、その部分を行わなかったのが主な理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初の計画には入れていなかったが、本年度の解析結果から遺伝子組換えマウスの行動解析を行うことで何らかの情報が得られる可能性が出てきたので、当初の計画を強化することを意図してその実験を追加する。
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