2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of gene targeting strategies for amphibian research using genome editing
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15K06802
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
鈴木 賢一 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 特任准教授 (90363043)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ネッタイツメガエル / イベリアトゲイモリ / ゲノム編集 / ノックイン / トランスジェニック |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題の最終年度となる平成２９年度は、ヒト病態遺伝子を持つネッタイツメガエルの作製ならびにイベリアトゲイモリにおける高効率トランスジェニックシステムの開発を遂行した。まず、昨年度に引き続きネッタイツメガエルおよびイベリアトゲイモリのゲノム編集効率を向上させるために、リコンビナントCas9タンパク質とsgRNAをRNP複合体として導入する条件について検討した。次世代シークエンサーを用いてアンプリコン解析を行ったところ、驚くべきことに、全ての胚において変異導入効率が98%を超える個体が複数確認された。最終的に、両生類におけるファウンダー胚(F0)での迅速な遺伝子機能解析を可能とするシステムの確立に成功した。
次に、ネッタイツメガエルの遺伝子X領域に疾患変異型ヒトX遺伝子 cDNAのノックインを行い、F0およびF1個体の作出を試みた。CRISPR-CasとMMEJドナーベクターを顕微注入し、PCRによるジェノタイピングの後、ノックインポジティブF0個体を性成熟させ、F1世代を作出した。得られたF1世代個体についてジェノタイピングを行ったが、ドナーベクターの標的領域へのノックインは確認できなかった。F0体細胞へのノックインがジェノタイプにより確認されていることを考慮すると、この結果は生殖系列へのノックイン効率が低いことを示唆している。今後、残りのジェノタイプポジティブF0個体も性成熟させ、F1個体の作出を引き続き行っていく。
また、イベリアトゲイモリのsafe harbor siteの同定に成功し、このsiteへのドナーベクターのMMEJノックインにも成功した。レポーター蛍光は全身性で安定して発現しており、高効率トランスジェニックシステム技術開発の目処が立った。今後はF1の作出を行い、生殖系列への伝播を確認する予定である。
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Research Products
(4 results)
