2016 Fiscal Year Research-status Report
配偶子形成過程および初期発生におけるUHRF1の役割の解明
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15K06803
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
鵜木 元香 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (30525374)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | UHRF1 / 初期発生 / 配偶子形成 / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Uhrf1はDnmt1と共にDNAメチル化の維持に必須のタンパク質である。これまでに私たちはUhrf1は卵子および初期胚では主に細胞質に存在し、Uhrf1母方ノックアウトマウス胚が着床前後に致死となることを見出し、この表現型がDnmt1母方KO胚よりも重篤なことから、Uhrf1はDNAメチル化維持以外にも役割があると考え研究を進めてきた。昨年度は連携研究者の小倉先生と共に、野生型受精卵とUhrf1母方KO胚の前核置換実験を行い、卵子形成期及び初期発生時に特異的に細胞質に存在するUhrf1が、初期発生において重要な役割を果たしていることを明らかにした。今年度は連携研究者の山縣先生と共に、Uhrf1母方KO胚の発生過程の動画解析をおこない、Uhrf1は初期発生において正常な染色体分配と細胞分裂に重要であることを見出した。またUhrf1は少ないながらも核に一部局在するので、卵子形成期及び初期発生におけるUhrf1がDNAメチル化に与える影響をPBAT法にて調べ、Uhrf1は卵子形成期に起こる新規DNAメチル化の1/4程度に寄与しており、その領域が転写が不活性な領域であることを明らかにした。またUhrf1が初期胚で起こるゲノムワイドなDNA脱メチル化に抗してメチル化を維持する領域は、H3K9me3が集積している領域であることを見出し、これらの成果を論文にまとめて投稿し、現在査読が終わり、リバイス中である（Maenohara et al., リバイス中）。またプロテオミクス解析をbiological triplicateで行い、より信頼性の高いデータを得た。以前の解析でもチューブリンサブファミリータンパク質が減少していたが、今回の解析でもこの結果を再確認することができ、Uhrf1は卵子の細胞骨格形成に重要な役割を担っていることを明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画通り、これまでに私たちは連携研究者の小倉先生と共に、野生型受精卵とUhrf1母方KO胚の前核置換実験を行い、卵子形成期及び初期発生時に特異的に細胞質に存在するUhrf1が初期発生において重要な役割を果たしていることを明らかにし、連携研究者の山縣先生と共に、Uhrf1母方KO胚の発生過程の動画解析をおこない、Uhrf1は初期発生において正常な染色体分配と細胞分裂に重要であることを明らかにすることができた。また少ないながらも核に一部局在するUhrf1が卵子形成期に転写が不活発な領域の新規DNAメチル化に寄与すること、初期胚で起こるゲノムワイドなDNA脱メチル化に抗してH3K9me3が集積している領域のDNAメチル化を維持することを見いだすことができた 。またmRNA-seq解析もプロテオミクス解析も計画通りおこない、有用な情報を得ることができている。しかしながら、Uhrf1母方KO胚が示す重篤な表現型が、Uhrf1のどのような機能に起因するのか、Uhrf1がなぜこの時期に細胞質に局在するのか明らかにできていない。そのため研究はおおむね順調に進んでいるが、完璧とは言えない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の当初予定は、Uhrf1 Dppa3-MCMPマウスを用いてUhrf1の精子形成過程における役割を明らかにすることであった。それに向けてUhrf1 Dppa3-MCMPマウスを作製し、予備実験を行ったところ、このマウスでは予想に反してUhrf1のノックアウト効率が低く、条件検討をさまざま行ったが、良い条件を見つけることができなかった。そのため、Uhrf1の精子形成過程における役割の解明は断念し、Uhrf1母方KO胚が示す重篤な表現型が、Uhrf1のどのような機能に起因するのかの解明に全力を傾けようと考えている。当初計画では、in vitro合成した野生型Uhrf1 mRNAとUhrf1のそれぞれのドメイン変異mRNAを受精卵に注入し、レスキュー実験をおこなう予定であったが、それに加えてUhrf1が持つ５つのドメインの各変異体をCRISPR/Cas9システムを用いて作製し、その変異体マウスの機能解析から、Uhrf1のどのドメインがUhrf1母方KO胚の重篤な表現型に寄与しているのか特定したいと考えている。Uhrf1の５つのドメインは、核内ではそれぞれ特有の機能を担っている（TTD-PHDはヒストン修飾の認識、SRAドメインはヘミメチル化DNAの認識、RINGドメインはヒストンのユビキチン化）。よってどのドメインが重要かを特定できれば、既知の機能を手がかりに、Uhrf1の卵子及び初期胚における役割をより深く理解することが可能だと考えられる。
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| Causes of Carryover |
今年度はUhrf1の初期発生における役割を明らかにするためにおこなう予定だったin vitro合成した野生型Uhrf1 mRNAとUhrf1のそれぞれのドメイン変異mRNAを用いたレスキュー実験とその評価が、途中までしか進まなかった。現在までに野生型Uhrf1 mRNAとUhrf1のそれぞれのドメイン変異mRNAの準備までが終了し、これからそれらを用いてレスキュー実験をする予定である。レスキューできたかどうかの評価で行う予定だったメチローム解析及びmRNA-seq解析にかかる費用が次年度に繰り越された。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度はレスキュー実験の続きをすると共に、当初計画にはなかったが、Uhrf1の卵子および初期発生における機能をさらに深く調べるために、Uhrf1の５つのドメインの各変異体をCRISPR/Cas9システムを用いて作製することを計画している。レスキュー実験の評価及びUhrf1のドメイン変異体の機能解析として、メチローム解析、mRNA-seq解析、プロテオミクス解析などをおこないたいと考えている。そのための費用として、前年度の繰越金を使用させて頂く。
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Research Products
(5 results)
