2015 Fiscal Year Research-status Report
新規の遺伝子発現制御マウスを用いたＩｎｖ遺伝子の機能解析
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15K06808
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
渡邉 大介 北里大学, 理学部, 講師 (00260175)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | inv遺伝子 / トランスジェニックマウス / コンディショナルノックアウトマウス / 左右軸形成 / 多発性嚢胞腎 / 繊毛 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Inv 遺伝子の変異をホモで有するマウスは、内臓の位置がすべて左右逆転する完全内臓逆位の表現型を表すとともに、腎臓に多数の水泡を形成する多発性嚢胞腎を発症する。また最近、乳児期において発症する家族性若年性ネフロン癆(NPHP2) はヒトのINV遺伝子の変異が原因であることが明らかとなっている。しかしInv 遺伝子の左右軸形成や腎臓ならびにその他の組織における生理学的な機能は未だ明らかにされていない。
これまでに我々はInv遺伝子変異をレスキューしたトランスジェニックマウスを作製し、Inv蛋白質が細胞の繊毛内で機能していることを証明した。また最近我々は、Inv遺伝子に対するRNAiノックダウントランスジェニックマウスの作製に成功し、その解析結果を報告した（2014, PLoS ONE）。これら結果はin vivoにおいても機能的な分子を標的としたRNAiが可能であることを証明するとともに、Inv遺伝子の成体組織に新たな機能の存在が示された。しかし従来の研究手法ではその解析が困難なため、本研究においては組織特異的に特定のレスキュー遺伝子を欠失させる新たな手法（コンディショナルレスキュー法）を考案し研究を進めている。
コンディショナルレスキュー法はノックアウトマウスの作製と比べ、短時間かつ低コストで目的とする遺伝子の機能解析が確実に可能となる。またその作製にはES細胞を必要としないことから、マウス以外の動物（ラット,サル,牛, 豚 等）の研究にも応用可能な新規の遺伝子機能の解析技術であり、他の研究分野への応用が期待される。
平成27年度の研究においては主にコンディショナルレスキューマウス作製に必要とされるベクターを構築し、その効果をin vitroにおいて解析した、さらに構築したベクターを用いて、トランスジェニックマウスの作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
繊毛内に特異的に存在するInvタンパク質の挙動をリアルタイムに観察するため、Inv遺伝子とGFPの融合遺伝子を発現するトランスジェニックマウスより初代培養繊維芽細胞を作製し、GFP蛍光を指標とし観察を行った。繊毛に存在するInvタンパク質の蛍光は微細であるため、長作動距離・高開口度レンズを使用し、また光源にはLEDを用いることにより、細胞へのダメージを最小限に抑え観察することが可能となった。さらに他の蛍光蛋白質とInv遺伝子の融合遺伝子を発現するベクターを構築し、それらの遺伝子発現を観察した。
コンディショナルレスキューマウス作製に関しては、先ずEF1αプロモーター下にInv遺伝子とGFPの融合遺伝子を恒常的に発現するベクターの両端にlox配列を挿入することによって、cre遺伝子の発現依存的にその発現が欠失するベクターを構築した。このベクターの効果を調べるため、作製したベクターをES細胞にcre遺伝子 存在/非存在下で共遺伝子導入を行った結果、cre遺伝子が存在する場合はInv遺伝子とGFPの融合タンパク質の発現が特異的に抑制されていることが抗体染色により確認された。in vitroでの実験においてベクターの機能が確認されたため、作製したベクターをもちいてコンディショナルレスキュートランスジェニックマウスの作製を進めた。
FVB系統マウスより得られた受精卵に上記のベクターDNAをマイクロインジェクション法により導入した結果、全4回の遺伝子導入により約60匹の新生児マウスを得た。得られたマウスの血液よりゲノムDNAを回収し解析した結果、9匹のマウスから導入したベクター遺伝子の存在が高効率で確認された。現在得られたトランスジェニックマウスを交配し各系統マウスを作製するとともに、生殖細胞への寄与ならびに導入した遺伝子の発現確認を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の研究においてInvタンパク質のライブセルイメージング手法が確立されたため、本年度もその手法をもちいたInvタンパク質の繊毛での挙動の観察ならびにGFP以外の新たな蛍光蛋白質を用いた解析を進める。
コンディショナルレスキュートランスジェニックマウスに関しては昨年度までの研究において導入遺伝子が確認されたトランスジェニックマウスが9匹得られたことから、まずこれらマウスの解析を進める。現在導入遺伝子の次世代への伝播は3系統のマウスで確認がされている。引き続き交配を進め、導入遺伝子の生殖細胞への寄与を確認するとともに、各トランスジェニックマウス系統を樹立する。さらに各系統マウスでのInvタンパク質の発現を確認するとともにInv変異マウスとの間で交配を進め、導入されたInv遺伝子のInv変異マウスの表現型(内蔵逆位、嚢胞腎)に対する影響を調べる。完全にInv変異マウスの表現型をレスキューするマウス系統が得られた場合は先ず、神経組織特異的にcre遺伝子が活性されるP0-Creマウスとの間で交配を行う。次に神経組織特異的にInv遺伝子が不活性化されたマウスの表現型を解析し、新生児致死性のためこれまで解析がなされなかったInv遺伝子の神経組織における機能を考察する。Inv変異マウスの表現型をレスキューするマウス系統が得らなかった場合は、プロモーターなどを改変したベクターを再構築し、再度トランスジェニックマウスの作製を行う。
また本研究で開発した手法を一般化するため、Inv遺伝子以外の遺伝子においても簡便にコンディショナルレスキューマウスが作成可能となるベクターや、導入された遺伝子の発現が蛍光により容易に分別が可能となるベクターの開発を進める。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた研究計画が少しずれ、主に細胞培養ならびにトランスジェニックマウス作製等のにかかる物品費の多くが次年度に必要とされるようになったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在研究内容によっては多少の遅延が存在するが、ほぼ順調に進行している。当初の予定どおり、主に細胞培養ならびにトランスジェニックマウス作製等にかかる物品費として昨年度の繰り越し分の予算を使用する計画である。
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