ヒト化肝臓キメラマウスを用いたオミクス解析によるB型肝炎の病態解明と標的同定

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06810
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 坪田 昭人 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90322643)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: B型肝炎 / B型肝炎ウイルス / ヒト化肝臓キメラマウス / トランスクリプトーム解析

Outline of Annual Research Achievements

B型慢性肝炎の治療は、核酸アナログ体の出現により顕著な進歩を遂げたが、環状二本鎖DNAウイルスであるB型肝炎ウイルス（hepatitis B virus, HBV）を完全に駆除できない。臨床的には患者間や個人内での経過に幅広い多様性があり、治療に難渋することも少なくない。このような状況を克服するには、HBVの増殖を抑制するだけではなく、完全に排除する新たな分子標的が必要である。本研究の目的は、低コストで安定した動物モデルを確立することと、その動物モデルを用いてHBVが急性感染から慢性化するまでの肝組織内トランスクリプトーム変動を網羅的に解析することにより慢性化の機序を解明することである。
HBVには適切な実験培養系がなく、臨床検体は倫理的問題も含め入手利用に限界がある。臨床とin vitroの橋渡しとしてヒト肝細胞で置換されたキメラマウスが現時点では最適である。その多くは一部企業が専有し、非常に高価で動物の死亡率も高い。我々は、TK-NOGマウスを用いて、独自のprotocolと移植方法の工夫で、より確実に置換率の高いヒト化肝臓キメラマウスモデルを低コスト（10分の1以下に抑制）で確立できた。
HBVは肝細胞に吸着・侵入後、HBV自身に有利な環境を作りながら宿主に適応すると考えられる。特に侵入直後の段階で肝細胞にどのような変化が起きているか、十分にわかっていない。本研究でHBV感染ヒト化肝臓キメラマウスを用いて時系列に網羅的トランスクリプトーム解析を行った結果、感染後の癌関連増殖因子や免疫関連遺伝子の高発現も含めた興味深い知見が得られた。プロテオームやメタボロームの解析も含めて感染成立機序を解明することで感染阻止の分子標的を特定でき得ると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

安定した置換率の高いヒト化肝臓キメラマウスを従来より著しく抑えたコストで作成することが可能になった。この動物モデルを用いることで、HBV感染実験を以前より安易に行えるようになった。Preliminaryな網羅的トランスクリプトーム解析は終了しており、その結果、感染後の癌関連増殖因子や免疫関連遺伝子の高発現も含めた興味深い知見が得られている。現在、そのデータを発展的に確証する再現実験を行っている。
Bioinformaticsにより網羅的トランスクリプトームの結果からmRNA-miRNA-small RNA-proteinの関連解析を行っており、mRNA-miRNA interaction解析及びvalidationの実験を現在進めている。また、感染初期における時系列的メタボローム解析も行っており、感染初期の病態をトランスクリプトーム解析との関連も含めて検討している。

Strategy for Future Research Activity

ヒト化肝臓キメラマウスのHBV感染実験から得られた網羅的遺伝子解析データを更に発展的に絞り込む。BioinformaticsによりmRNA-miRNA-small RNA-proteinのinteraction解析を行い、その相互作用をin vitro実験系でvalidationを行う。特に感染初期における時系列的メタボローム解析による感染初期のHBV代謝関連病態を明らかにし、肝細胞膜蛋白に対する網羅的比較定量プロテオミクス技術を用いたプロテオーム解析によりHBV受容体候補を探索する。HBV初期感染から慢性感染に至る遺伝子や蛋白の動向からHBV感染成立の機序や感染初期の病態解明、及び絞り込まれた有力な分子標的候補をin vitro knockdown/overexpression実験系やヒト化肝臓キメラマウスを用いて機能解析を行い、新たな治療の発展につながり得る可能性を模索する。

Causes of Carryover

本研究が開始される以前より既に一部の研究内容は開始されていた。その研究のデータ解析は本研究にも重なるため、優先的かつ重点的に行った。また、その結果により続く本研究の実験系が大きく影響を受けるためでもあった。結果的に当該年度に新規に購入する消耗品等が予定より少なく抑えられた。ただ次年度以降に続く研究には予定通りに使用する。

Expenditure Plan for Carryover Budget

HBV急性感染から慢性感染へ成立する病態・機序に深く関与すると考えられる遺伝子群についてmRNA-miRNA-small RNA-proteinの相互関連性と調整機構についてin vitro実験系により詳細な検討を行う。またヒト化肝臓キメラマウスを用いたHBV感染実験からも再現・実証実験を行う。主要な遺伝子を効率良くknockdownさせることで、慢性感染を阻止でき得るかの検討も行う。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation of factors associated with relapse in telaprevir-based triple therapy for chronic hepatitis C. (2016)
  • Author(s): 1.Kondo C, Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Abe H, Aizawa Y.
  • Journal Title: J Postgrad Med Volume: 62 Pages: 20-25
  • DOI: 10.4103/0022-3859.173191
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of sorafenib combined with low-dose interferon therapy for advanced hepatocellular carcinoma: a pilot study. (2016)
  • Author(s): 2.Itokawa N, Atsukawa M, Tsubota A, Okubo T, Arai T, Nakagawa A, Kondo C, Iwakiri K.
  • Journal Title: Int J Clin Oncol Volume: Epub ahead of print Pages: xx-yy
  • DOI: PMID: 26701173
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of native vitamin D3 supplementation on refractory chronic hepatitis C patients in simeprevir with pegylated interferon/ribavirin. (2016)
  • Author(s): 4.Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Yoshizawa K, Abe H, Asano T, Ohkubo Y, Araki M, Ikegami T, Okubo T, Kondo C, Osada Y, Nakatsuka K, Chuganji Y, Matsuzaki Y, Iwakiri K, Aizawa Y.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: Epub ahead of print Pages: xx-yy
  • DOI: 10.1111/hepr.12575
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Impact of Chronic Hepatitis C Virus Genotype 1b Infection on Triglyceride Concentration in Serum Lipoprotein Fractions. (2015)
  • Author(s): 3.Nagano T, Seki N, Tomita Y, Sugita T, Aida Y, Itagaki M, Sutoh S, Abe H, Tsubota A, Aizawa Y.
  • Journal Title: Int J Mol Sci Volume: 16 Pages: 20576-20594
  • DOI: 10.3390/ijms160920576
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Influencing factors on serum 25-hydroxyvitamin D3 levels in Japanese chronic hepatitis C patients. (2015)
  • Author(s): Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Yoshizawa K, Abe H, Asano T, Ohkubo Y, Araki M, Ikegami T, Kondo C, Itokawa N, Nakagawa A, Arai T, Matsushita Y, Nakatsuka K, Furihata T, Chuganji Y, Matsuzaki Y, Aizawa Y, Iwakiri K.
  • Journal Title: BMC Infect Dis Volume: 15 Pages: 344
  • DOI: 10.1186/s12879-015-1020-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differential inhibition features of direct-acting anti-hepatitis C virus agents against human organic anion transporting polypeptide 2B1. (2015)
  • Author(s): Furihata T, Fu Z, Suzuki Y, Matsumoto S, Morio H, Tsubota A, Matsumoto S, Chiba K.
  • Journal Title: Int J Antimicrob Agents Volume: 46 Pages: 381-388
  • DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2015.05.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Vitamin D-related gene polymorphisms do not influence the outcome and serum vitamin D level in pegylated interferon/ribavirin therapy combined with protease inhibitor for patients with genotype 1b chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Arai T, Atsukawa M, Tsubota A, Kondo C, Shimada N, Abe H, Itokawa N, Nakagawa A, Okubo T, Aizawa Y, Iwakiri K.
  • Journal Title: J Med Virol Volume: 87 Pages: 1904-1912
  • DOI: 10.1002/jmv.24244
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interferon-λ3 polymorphisms in pegylated-interferon-α plus ribavirin therapy for genotype-2 chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Ishiguro H, Abe H, Seki N, Sugita T, Aida Y, Itagaki M, Sutoh S, Shimada N, Furihata T, Tsubota A, Aizawa Y.
  • Journal Title: World J Gastroenterol Volume: 21 Pages: 3904-3911
  • DOI: 10.3748/wjg.v21.i13.3904
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Safety and efficacy of partial splenic embolization in telaprevir-based triple therapy for chronic hepatitis C. (2015)
  • Author(s): Kondo C, Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Abe H, Itokawa N, Nakagawa A, Fukuda T, Matsushita Y, Nakatsuka K, Kawamoto C, Iwakiri K, Aizawa Y, Sakamoto C.
  • Journal Title: Intern Med Volume: 54 Pages: 119-126
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.54.3066
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Factors associated with sustained virological response in 24-week telaprevir-based triple therapy for chronic hepatitis C genotype 1b patients with the IL28B minor genotype. (2015)
  • Author(s): Abe H, Tsubota A, Shimada N, Atsukawa M, Kato K, Takaguchi K, Asano T, Chuganji Y, Sakamoto C, Toyoda H, Kumada T, Ide T, Sata M, Aizawa Y.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 45 Pages: 387-396
  • DOI: 10.1111/hepr.12360
• [Presentation] Serum 25(OH)D3 levels are related to the severity of liver fibrosis in patients with NAFLD (2016)
  • Author(s): Arai T, Atsukawa M, Kondo C, Itokawa N, Nakagawa A, Okubo T, Kato K, Tsubota A, Iwakiri K
  • Organizer: APASL (2016 in Tokyo, 25th Conference)
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2016-02-23
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Efficacy of daclatasvir/asunaprevir for chronic hepatitis C patients with renal insufficiency (2016)
  • Author(s): Kondo C, Atsukawa M, Shimada N, Tsubota A, Abe H, Okubo T, Nakagawa A, Arai T, Itokawa N, Tanaka Y, Aizawa Y, Iwakiri K
  • Organizer: APASL (2016 in Tokyo, 25th Conference)
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2016-02-22
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] C型慢性肝疾患に対するダクラタスビル･アスナプレビルの初期治療効果の検討 (2015)
  • Author(s): 加藤慶三,塙 紀子,米澤 健,佐藤祥之,井家麻紀子,清水昌平,松尾亮太,坪田昭人
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] DAAsに対するNS5A領域の薬剤耐性変異を有する症例の特徴 (2015)
  • Author(s): 大久保知美,厚川正則,島田紀朋,安部宏,吉澤海,新井康央,中川愛,糸川典夫,近藤千紗,相澤良夫,坪田昭人,岩切勝彦
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] SMV3剤併用療法の難治要因の検討 (2015)
  • Author(s): 島田紀朋,厚川正則,田中靖人,坪田昭人
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] DCV+ASV併用療法の薬剤耐性変異別の治療効果及びAFPの推移 (2015)
  • Author(s): 島田紀朋,厚川正則,安部宏,吉澤海,田中靖人,坪田昭人,相澤良夫
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] 治療開始4週後のHCV RNA量から見たSMV3剤併用療法の治療効果予測 (2015)
  • Author(s): 島田紀朋,厚川正則,安部宏,吉澤海,高口浩一,石川達,辻邦彦,熊田卓,飯尾悦子,田中靖人,平岡淳,坪田昭人,相澤良夫
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] C型慢性肝炎に対するDCV/ASV療法の成績に与える因子の解析 (2015)
  • Author(s): 厚川正則,島田紀朋,吉澤海,安部宏,大久保知美,新井康央,中川愛,糸川典夫,近藤千紗,坪田昭人,相澤良夫,岩切勝彦
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪･国際館パミール（東京）
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] DAAsに対するNS5A領域の薬剤耐性変異を有する症例の特徴 (2015)
  • Author(s): 大久保知美,厚川正則,島田紀朋,吉澤海,安部宏,新井康央,中川愛,糸川典夫,近藤千紗,相澤良夫,坪田昭人
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 鶴屋東館（熊本）
  • Year and Date: 2015-05-22
• [Presentation] C型慢性肝炎に対するDCV/ASV療法の成績にHost因子が与える影響 (2015)
  • Author(s): 厚川正則,島田紀朋,吉澤海,安部宏,大久保知美,新井康央,中川愛,糸川典夫,近藤千紗,松下洋子,坪田昭人,相澤良夫
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 鶴屋東館（熊本）
  • Year and Date: 2015-05-22
• [Presentation] 肝硬変に伴う腹水に対するトルバプタンの治療成績 (2015)
  • Author(s): 加藤慶三,塙 紀子,米澤 健,佐藤祥之,井家麻紀子,清水昌平,松尾亮太,坪田昭人
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: 鶴屋東館（熊本）
  • Year and Date: 2015-05-22
• [Presentation] SMV３剤併用療法の成績から見た難治要因の検討 (2015)
  • Author(s): 島田紀朋,厚川正則,坪田昭人,吉澤海,安部宏,加藤慶三,大久保雄介,平岡淳,高口浩一,石川達,辻邦彦,豊田秀徳,熊田卓,田中靖人,相澤良夫
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテル日本航空（熊本）
  • Year and Date: 2015-05-21
• [Presentation] 静脈瘤治療に対する抗ウイルス治療の影響 (2015)
  • Author(s): 加藤慶三,島田紀朋,坪田昭人
  • Organizer: 第100回日本消化器病学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2015-04-24
• [Presentation] Genotype 1b C型慢性肝炎に対するSimeprevir+Peginterferon+Ribavirin３剤療法の早期治療効果 (2015)
  • Author(s): 杉田知典,安部 宏,富田陽一,永野智久,関 伸嘉,会田雄太,板垣宗徳,須藤 訓,坪田昭人,相澤良夫
  • Organizer: 第100回日本消化器病学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2015-04-24
• [Presentation] IFN反応性とウイルス変異から見た治療戦略 (2015)
  • Author(s): 島田紀朋,厚川正則,坪田昭人
  • Organizer: 第100回日本消化器病学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2015-04-23
• [Presentation] C型慢性肝炎治療におけるvitamin Dの影響～vitamin D併用SMV３剤併用療法RCTから得られた知見～ (2015)
  • Author(s): 厚川正則,島田紀朋,坪田昭人
  • Organizer: 第100回日本消化器病学会総会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター（仙台）
  • Year and Date: 2015-04-23