ヒト化肝臓キメラマウスを用いたオミクス解析によるB型肝炎の病態解明と標的同定

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06810
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 坪田 昭人 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90322643)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: B型肝炎 / B型肝炎ウイルス / ヒト化肝臓キメラマウス / トランスクリプトーム解析

Outline of Annual Research Achievements

B型慢性肝炎の治療は、核酸アナログ体の出現により革新的な進歩を遂げたが、その核酸アナログ体の作用機序は限定的であり、特異的な生活環を有するB型肝炎ウイルス（hepatitis B virus, HBV）を完全に感染肝細胞内から排除できない。また患者間や個人内での臨床経過に幅広い多様性があるB型肝炎では、治療に難渋することも少なくない。このような状況を打開するには、HBVの増殖を抑制するだけではなく、完全に排除する新たな分子標的が必要である。本研究の目的は、低コストで安定した動物モデルを確立し、その動物モデルを用いてHBVが急性感染から慢性化するまでの肝組織内トランスクリプトーム変動を網羅的に解析することにより慢性化の機序を解明することである。
HBVには適切な実験培養系がなく、臨床検体は倫理的問題も含め入手利用に限界がある。臨床とin vitroの橋渡しとしてヒト肝細胞で置換されたキメラマウスが現時点では最適である。その多くは一部企業が専有し、非常に高価で動物の死亡率も高い。我々は、TK-NOGマウスを用いて、独自のprotocolと移植方法の工夫で、より確実に置換率の高いヒト化肝臓キメラマウスモデルを低コスト（10分の1以下に抑制）で確立できた。
HBVは肝細胞に吸着・侵入後、HBV自身に有利な環境を作りながら宿主に適応すると考えられる。特に侵入直後の段階で肝細胞にどのような変化が起きているか、十分にわかっていない。本研究でHBV感染ヒト化肝臓キメラマウスを用いて時系列に網羅的トランスクリプトーム解析を行った結果、感染後の癌関連増殖因子や免疫関連遺伝子の高発現も含めた興味深い知見が得られた。プロテオーム解析やメタボローム解析も含めて感染成立機序を解明することで感染阻止の分子標的を特定でき得ると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

従来と比較して著しく抑えられたコストで置換率の高いヒト化肝臓キメラマウスを作成することが可能になった。この動物モデルを用いてHBV感染実験を行っている。網羅的トランスクリプトーム解析は終了しており、その結果、感染後の癌関連増殖因子や免疫関連遺伝子の高発現も含めた興味深い知見が得られている。意外なことは、高発現遺伝子群より圧倒的に低発現遺伝子群が多いことであった。
Bioinformaticsにより網羅的トランスクリプトームの結果からmRNA-miRNAの関連解析を行った結果、いくつかの有意なmRNAとmiRNAに絞られた。mRNA-miRNA interaction解析及び実験をin vitroで進めている。また、感染初期における時系列的メタボローム解析を行っており、感染初期の病態をトランスクリプトーム解析との関連も含めて検討している。
以上より網羅的トランスクリプトーム解析は予定通りに進んだ。プロテオミクス解析やメタボロミクス解析はやや遅れているが、研究全体を通して「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

ヒト化肝臓キメラマウスのHBV感染実験から得られた網羅的遺伝子解析データにより初期感染から慢性期に移行する際に有意に関与すると考えられるmRNAとmiRNAを絞り込むことができた。現在、HBV感染培養肝細胞を用いたin vitro実験で、絞り込んだmiRNAとmRNAがHBV増殖にどのように影響しているかを検証しているところである。両者が互いに必要とするcounterpartが明らかになれば、small RNA-proteinのinteraction解析を行い、その相互作用を更にin vitro実験系でvalidationを行う。特に感染初期における時系列的メタボローム解析による感染初期のHBV代謝関連病態を明らかにし、肝細胞膜蛋白に対する網羅的比較定量プロテオミクス技術を用いたプロテオーム解析によりHBV受容体候補を探索する。HBV初期感染から慢性感染に至る遺伝子や蛋白の動向からHBV感染成立の機序や感染初期の病態解明、及び絞り込まれた有力な分子標的候補をin vitro knockdown/overexpression実験系やヒト化肝臓キメラマウスを用いて機能解析を行い、新たな治療の発展につながり得る可能性を模索する。

Causes of Carryover

ヒト肝臓化キメラマウスの作製には、約６ヶ月を要する。そのため搬入時期やその後のマウスへのヒト肝細胞生着時期・一定のアルブミン生成能力になるまでの期間に個々のマウスで差が生じることはやむを得ないのが現状である。それにより使用計画がずれてしまったためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記の通り使用計画がずれてしまったが、mRNAやmiRNAの感染実験に関係する消耗品に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Daclatasvir and asunaprevir for genotype 1b chronic hepatitis C patients with chronic kidney disease (2017)
  • Author(s): Kondo C, Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Abe H, Asano T, Yoshizawa K, Okubo T, Chuganji Y, Aizawa Y, Iio E, Tanaka Y, Iwakiri K.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 47 Pages: 1165-1173
  • DOI: 10.1111/hepr.12879
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical Significance of Two Real-Time PCR Assays for Chronic Hepatitis C Patients Receiving Protease Inhibitor-Based Therapy (2017)
  • Author(s): Inoue T, Hmwe SS, Shimada N, Kato K, Ide T, Torimura T, Kumada T, Toyoda H, Tsubota A, Takaguchi K, Wakita T, Tanaka Y.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12 Pages: e0170667
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0170667
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] C-Arm Cone Beam Computed Tomography Guidance for Radiofrequency Ablation in Hepatocellular Carcinoma (2017)
  • Author(s): Kato K, Abe H, Ika M, Yonezawa T, Sato Y, Hanawa N, Shimizu S, Endo S, Matsuo R, Tsubota A.
  • Journal Title: Oncology Volume: 92 Pages: 142-152
  • DOI: 10.1159/000453665
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human organic anion transporter 2 is an entecavir, but not tenofovir, transporter (2017)
  • Author(s): Furihata T, Morio H, Zhu M, Suzuki Y, Ide H, Tsubota A, Fu Z, Anzai N, Chiba K.
  • Journal Title: Drug Metab Pharmacokinet Volume: 32 Pages: 116-119
  • DOI: 10.1016/j.dmpk.2016.09.004
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficacy of daclatasvir/asunaprevir according to resistance-associated variants in chronic hepatitis C with genotype 1 (2017)
  • Author(s): Iio E, Shimada N, Abe H, Atsukawa M, Yoshizawa K, Takaguchi K, Eguchi Y, Nomura H, Kuramitsu T, Kang JH, Matsui T, Hirashima N, Tsubota A, Kusakabe A, Hasegawa I, Miyaki T, Shinkai N, Fujiwara K, Nojiri S, Tanaka Y.
  • Journal Title: J Gastroenterol Volume: 52 Pages: 94-103
  • DOI: 10.1007/s00535-016-1225-x
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Association between vitamin D deficiency and pre-existing resistance-associated hepatitis C virus NS5A variants (2016)
  • Author(s): 1.Okubo T, Atsukawa M, Tsubota A, Shimada N, Abe H, Yoshizawa K, Arai T, Nakagawa A, Itokawa N, Kondo C, Aizawa Y, Iwakiri K.
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12784
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hepatitis C virus G1b infection decreases the number of small low-density lipoprotein particles (2016)
  • Author(s): 2.Kinoshita C, Nagano T, Seki N, Tomita Y, Sugita T, Aida Y, Itagaki M, Satoh K, Sutoh S, Abe H, Tsubota A, Aizawa Y.
  • Journal Title: World J Gastroenterol Volume: 22 Pages: 6716-25
  • DOI: 10.3748/wjg.v22.i29.6716
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of sorafenib combined with low-dose interferon therapy for advanced hepatocellular carcinoma: a pilot study (2016)
  • Author(s): 3.Itokawa N, Atsukawa M, Tsubota A, Okubo T, Arai T, Nakagawa A, Kondo C, Iwakiri K.
  • Journal Title: Int J Clin Oncol Volume: 21 Pages: 676-83
  • DOI: 10.1007/s10147-015-0942-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-Nucleotide Resolution Mapping of Hepatitis B Virus Promoters in Infected Human Livers and Hepatocellular Carcinoma (2016)
  • Author(s): 4.Altinel K, Hashimoto K, Wei Y, Neuveut C, Gupta I, Suzuki AM, Dos Santos A, Moreau P, Xia T, Kojima S, Kato S, Takikawa Y, Hidaka I, Shimizu M, Matsuura T, Tsubota A, Ikeda H, Nagoshi S, Suzuki H, Michel ML, Samuel D, Buendia MA, Faivre J, Carninci P.
  • Journal Title: J Virol Volume: 90 Pages: 10811-22
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Usefulness of portal vein pressure for predicting the effects of tolvaptan in cirrhotic patients (2016)
  • Author(s): Nakagawa A, Atsukawa M, Tsubota A, Kondo C, Okubo T, Arai T, Itokawa N, Narahara Y, Iwakiri K.
  • Journal Title: World J Gastroenterol Volume: 22 Pages: 5104-13
  • DOI: 10.3748/wjg.v22.i21.5104
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Ultrastructure of hepatocytes in chronic hepatitis C patients who achieve a sustained virological response (2017)
  • Author(s): Aoyagi H, Iijima H, Puig-Basagoiti F, Xin Z, Kao YT, Hossam GE, Zaitsu T, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Shimada N, Kato K, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Wakita T, Aizaki H
  • Organizer: APASL 2017 (The 26th Conference of Asian Pacific Association for the Study of the Liver)
  • Place of Presentation: Beijing, China
  • Year and Date: 2017-02-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] HCVに対する抗ウイルス治療後、SVR後の肝細胞の超微細構造の変化 (2016)
  • Author(s): 青柳東代, 飯島尋子, 松田麻未, 渡士幸一, 鈴木亮介, 政木隆博, 坪田昭人, 和氣健二郎, 脇田隆字, 相崎英樹
  • Organizer: 第41回日本肝臓学会東部会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2016-12-08
• [Presentation] Efficacy and safety of ombitasvir/ritonavir/paritaprevir combination therapy for genotype 1b chronic hepatitis C patients complicated with chronic kidney disease (2016)
  • Author(s): Arai T, Atsukawa M, Ikegami T, Mikami S, Shimada N, Tsubota A, Kato K, Abe H, Okubo T, Nakagawa A, Itokawa N, Kondo C, Iwakiri K
  • Organizer: AASLD 2016 (The Liver Meeting, the 67th Conference of American Association for the Study of Liver Diseases)
  • Place of Presentation: Boston, MA, USA
  • Year and Date: 2016-11-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] C型慢性肝炎における背景因子の特徴による薬剤選択 (2016)
  • Author(s): 厚川正則, 島田紀朋, 大久保知美, 安部 宏, 加藤慶三, 三上 繁, 坪田昭人, 池上 正, 中願寺義通, 岩切勝彦
  • Organizer: 第20回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: 神戸コンベンションセンター（神戸）
  • Year and Date: 2016-11-04
• [Presentation] 本邦におけるNAFLD患者と血清ビタミンD代謝 (2016)
  • Author(s): 新井泰央, 厚川正則, 大久保知美, 中川 愛, 糸川典夫, 近藤千紗, 加藤慶三, 坪田昭人, 岩切勝彦
  • Organizer: 第20回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: 神戸コンベンションセンター（神戸）
  • Year and Date: 2016-11-03
• [Presentation] Ultrastructure of liver cells in chronic hepatitis C patients who achieve a sustained virological response (2016)
  • Author(s): Aoyagi H, Iijima H, Puig-Basagoiti F, Xin Z, Kao YT, Hossam GE, Zaitsu T, Matsuda M, Watashi K, Suzuki R, Masaki T, Tsubota A, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Wake K, Wakita T, Aizaki H
  • Organizer: The 15th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • Place of Presentation: Awaji, Japan
  • Year and Date: 2016-09-07
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] C型肝炎ウイルス治療後ウイルス学的著効症例の肝細胞の超微細構造の観察 (2016)
  • Author(s): 相崎英樹, 飯島尋子, 青柳東代, 松田麻未, 渡士幸一, 鈴木亮介, 政木隆博, 藤井さやか, 會澤信弘, 三又絢子, 酒巻有里子, 市野瀬志津子, 坪田昭人, 和氣健二郎, 脇田隆字
  • Organizer: 第23回肝細胞研究会
  • Place of Presentation: 大阪大学中之島センター（大阪）
  • Year and Date: 2016-07-08
• [Presentation] HCVに対する抗ウイルス治療後、SVR後の肝細胞の超微細構造の変化 (2016)
  • Author(s): 青柳東代, 飯島尋子, 松田麻未, 渡士幸一, 鈴木亮介, 政木隆博, 酒巻有里子, 市野瀬志津子, 坪田昭人, 和氣健二郎, 脇田隆字, 相崎英樹
  • Organizer: 第12回広島肝臓プロジェクト研究センターシンポジウム
  • Place of Presentation: ホテルグランヴィア広島（広島）
  • Year and Date: 2016-06-25
• [Presentation] 実臨床におけるGenotype 2のC型慢性肝炎患者に対するソホスブビル, リバビリン併用療法の治療成績 (2016)
  • Author(s): 近藤千紗, 厚川正則, 島田紀朋, 加藤慶三, 安部 宏, 大久保知美, 新井泰央, 中川 愛, 糸川典夫, 坪田昭人, 相澤良夫, 岩切勝彦
  • Organizer: 第52回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテルニューオータニ幕張/東京ベイ幕張ホール（千葉）
  • Year and Date: 2016-05-20
• [Presentation] Genotype１C型慢性肝疾患に対するダクラタスビル・アスナプレビルの初期治療反応と抗ウイルス効果の関係 (2016)
  • Author(s): 加藤慶三, 安部 宏, 井家麻紀子, 清水晶平, 佐藤祥之, 望月 司, 塙 紀子, 米澤 健, 遠藤慎治, 松尾亮太, 坪田昭人
  • Organizer: 第52回日本肝臓学会総会
  • Place of Presentation: ホテルニューオータニ幕張/東京ベイ幕張ホール（千葉）
  • Year and Date: 2016-05-19
• [Presentation] HCVに対する抗ウイルス治療後、SVR後の肝細胞の超微細構造の変化 (2016)
  • Author(s): 青柳東代, 飯島尋子, 渡士幸一, 鈴木亮介, 政木隆博, 坂巻有里子, 市野瀬志津子, 坪田昭人, 和氣健二郎, 脇田隆字, 相崎英樹
  • Organizer: 第26回抗ウイルス療法学会総会
  • Place of Presentation: 名古屋市立大学（名古屋）
  • Year and Date: 2016-05-13