2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト化マウスモデルにおけるHIV-1感染病態への粘膜局所自然免疫の関与の解明
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15K06811
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
大倉 定之 日本医科大学, 医学部, 助教 (10731036)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヒト化マウス / ウイルス感染 / 自然免疫 / 造血幹細胞 / 間葉系・間質系幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度には感染実験を実施するのに十分高いヒト免疫細胞の再構築が可能になった。
（１）移植する造血幹細胞は可能な限り幹細胞に近い方が、マウス骨髄内でのヒト由来の造血機能に有利になると考えられる。in vitro培養により増殖した造血幹細胞において、本来の幹細胞の比率を高めるため、間葉系幹細胞を3D培養しsphereとして培養し、造血幹細胞を共培養した。免疫蛍光染色を実施した結果、間葉系幹細胞sphere表面に造血幹細胞が相互作用していることが示された。この方法により、間葉系幹細胞sphere表面で造血幹細胞が相互作用し、幹細胞としての性質を保持すると考えられる。また3D培養することにより、間葉系幹細胞そのものも、幹細胞としての性質を保持できると考えられる。
（２）NSGマウスへの幹細胞移植方法として、27年度には心臓内移植および顔面静脈内移植方法を実施したが、移植後生存率や移植成功率、ヒト免疫細胞の再構築比率が低かった。顔面静脈内移植では個体によってはヒト由来の免疫細胞が認められたものの、ヒト由来細胞の比率は低かった。そこで28年度には肝臓内移植を実施し、移植後生存率が高くなると共に、末梢血において20～50％のヒト免疫細胞の再構築が可能となった。また、T細胞やB細胞、NK細胞に加えて、骨髄球系の細胞の再構築も認められた。これにより、マウスのヒト化の技術が確立した。
（３）感染実験に使用するベクターウイルスとして、HIV-1をベースとし、GFPおよびルシフェラーゼの両方を発現するデュアルレポーターベクターを構築した。培養細胞に感染させた結果、目的通り、両方のレポーター遺伝子を発現することが示された。このウイルスベクターを濃縮し、感染実験に用いられるように調整した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
飼育管理しているNSGマウスの繁殖が悪く、研究に若干の遅れが生じていたが、28年度に微生物モニタリングを実施した結果、本学実験動物管理区域内のSPF管理区域にて、区域全体で日和見菌（Staphylococcus属およびHelicobacter hepaticus）の汚染が認められた。同菌は日和見菌のため、通常の微生物モニタリングには検査項目として含まれていなかったが、NSGマウスは重度免疫不全のため、感染の影響が出たものと考えられる。このため、飼育していた全個体を安楽死により処分し、飼育室の部分的なクリーンアップを行い、新しく清浄マウスを購入し、コロニーを構築した。このため、研究実施に遅れが生じている。
これに関連し、米国The Jackson Laboratory社からの新規マウス購入も制限されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
NSGマウスの飼育については清浄マウスのコロニーが再構築されており、ヒト免疫細胞の再構築も技術的に確立できている。本年度（平成29年度）はヒト化マウスにデュアルレポーターウイルスを感染させ、感染直後の粘膜組織における自然免疫を解析する。また、皮膚組織内での免疫細胞についても解析を行い、どの程度、またどの免疫細胞がヒト由来かを明らかにした上で、ヘルペスウイルス等感染後の自然免疫の動態の解析も平行して行う予定でいる。
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| Causes of Carryover |
ヒト化マウスの骨髄球系細胞の再構築比率を高めるため、ヒトサイトカイン遺伝子をノックインしたトランスジェニックマウスを購入予定だったが、上記進捗状況欄で記載の通り、本学実験動物管理区域内のSPF区域にて日和見感染菌による汚染が認められたため、新規の免疫不全実験動物の導入が制限された。このため、新規免疫不全トランスジェニックマウスの購入のために確保していた約410，000円が未使用のままとなっている。
また遺伝子ノックアウトの目的で購入したCRISPR遺伝子のプラスミド2種類について、Addgene社から購入した分に関して、プラスミドが得られず、対応を協議するため、支払を停止している。このため、プラスミド購入価格約30，000円が未使用分となっている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ノックアウトマウスは本年度に購入して導入を予定している。またプラスミドもAddgene社から代替品が納入されれば、購入費用を送金する。このため、28年度未使用分はマウスの購入費用およびプラスミドの購入費用として予定通り、使用する。
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