2016 Fiscal Year Research-status Report
液体窒素およびドライアイスを用いないマウス胚と精子の保存および輸送法の新規開発
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15K06816
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
持田 慶司 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任技師 (60312287)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 凍結保存 / 胚 / 精子 / 冷蔵保存 / マウス輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス受精卵や精子の凍結保存技術は家畜やヒトに応用されてきたが、液体窒素もしくはドライアイスがなければ細胞内の氷晶形成や保存液による細胞への毒性等により冷凍温度での保存は不可能と考えられている。我々は-70℃～0℃、更に0℃～37℃の温度域での受精卵および精子の安定的な保存を目指して検討を行った。
1.受精卵：体外受精によって得られたマウス胚を各種凍結溶液等と共に凍結チューブに封入後、-80、-40、-20℃の各温度で保存を試みた。一般的な凍結液ではこれらの温度で生存できないが、我々が開発した高浸透圧ガラス化溶液を用いることで、-80℃では1週間以上、-40℃では数時間から1日、-20℃では数10分から1時間程度の保存が可能であり、これらの温度域での簡易輸送が可能と考えられた（2016年アメリカ繁殖学会で発表）。また冷蔵温度では、幾つかの環境要因を改善することで5～7日間の保存が可能となった。従来は2～3日の保存でも発生能の低下がみられたが、本実験ではガラス化保存-回収胚を5日間冷蔵保存しても生存率99％、胚盤胞への発生率71％と格段に安定した冷蔵保存法を開発できた。
2.精子：一般的な凍結保存液を用いた場合、-80℃では少なくとも7日間の保存が可能であった。-40℃でも5-7日間の保存ができ、一時的な保管や輸送の可能性が期待されるが、その受精率は低く、保存方法の改善が必須と考えられた。そして2016年に行った保存液の改良実験により、1971年に開発された従来法よりも高い受精率が得られたことから、新規凍結保存法のプロトコール確立の取り組みを進めている。
これらの技術はマウスのみならず、家畜やヒトおよび細胞への外挿、緊急災害時やフィールドワークおよび発展途上の国々など液体窒素やドライアイスが入手困難な状況でも応用可能と考えられ、様々な用途に発展する可能性を有する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
我々が開発した高浸透圧ガラス化溶液を用いることで、マウス胚を-40℃や-20℃でも短時間であれば保存および簡易輸送できると考えられた。また種々の条件検討により、ガラス化保存後に回収した胚を冷蔵温度で約1週間保存できることが分かってきた。冷蔵温度で安全かつ安価に輸送が可能と考えられることから、更なる条件設定およびプロトコール確立を現在進めている。
一方で、従来の精子凍結方法でも数日間ならば-40℃での保存が可能であることが確認できた。しかし、回収された精子の生存性や運動性および受精率が低いことから、一般的に普及するためには改善が必要であった。そこで様々な凍結条件や凍結液の組成の改良を試みたところ、ゴールデンスタンダードと考えられている従来法よりも高い運動性や受精率を得ることができた。だがその成績は不安定なことから、更に改良が必要と考えられる。
輸送実験が進められていない事から、本区分においてやや遅れているを選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.ガラス化保存-回収胚の保存条件の検討と輸送：冷蔵温度での5～7日間の保存が可能となってきたことから、更に安定的に保存するためのプロトコールの確立と輸送実験を行う。
2.新鮮精子および精巣上体の保管条件の検討：冷蔵温度での保管条件の検討および体外受精条件の精査により最適な保管条件の検討を行う。
3.凍結精子の保存および輸送法の新規開発：初年度より引き続き、マウス精子の凍結方法の改善を目指して凍結液の組成の改良を行う。特に近年、氷晶保護物質として効果が報告されているポリリジンの添加によって、凍結後の生存性や受精率の改善が一部においてみられたことから、これらを含む最適な凍結液の開発を更に進めていく。この開発が進めば、-40～-20℃での保存成績も改善が期待できる。
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| Causes of Carryover |
マウス胚の輸送実験が2016年度中に行えなかったため、そのためのマウス購入代金と輸送費を2017年度へ持ち越しとした。また日本卵子学会からの依頼で論文を投稿したため、投稿料金が掛からなかったことから未使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
マウス胚の輸送料金として20万円、論文投稿料として7万円の他に残金をマウス購入(およそ36匹×2000円)代金として、次年度での使用を計画している。
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