2015 Fiscal Year Research-status Report
ウイルスRNAの侵入を防御する宿主NMDとHTLV-1 RNAを守るRexの攻防
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15K06827
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中野 和民 東京大学, 新領域創成科学研究科, 助教 (60549591)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 俊樹 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (30182934)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | HTLV-1 / Rex / NMD / 宿主ウイルス相互作用 / ウイルスRNA / RNA代謝 / ウイルス発がん / ATL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト・レトロウィルスHuman T-cell Leukemia Virus Type-I（以下HTLV-1）は、ヒトT細胞に感染し速やかにヒトゲノムに組み込まれ、長い潜伏期間を経て極めて悪性度の高い末梢血T細胞腫瘍Adult T-cell Leukemia/Lymphoma（以下ATL）を引き起こす。しかし、HTLV-1の感染は主に授乳期に母親の母乳を介して起こるため、HTLV-1感染の実態と感染細胞がどのように腫瘍化していくのか、その分子メカニズムは解明されておらず、感染予防法、ATL発症予防法確立の妨げになっている。これまで私たちは、HTLV-1がコードするタンパク質のうち、特にRNA結合タンパク質Rexの機能に注目し研究を行ってきた。特にRNAウイルス防御機構として注目されている宿主細胞のmRNA品質管理機構Nonsense-Mediated mRNA Decay（以下NMD）をRexがどのように制御し、HTLV-1の自己複製に適した環境を整備しているのか、宿主細胞の防御機構とウイルス因子の、新しい攻防の分子メカニズムを明らかにすることを目的に、研究をスタートさせた。
これまでRexは、核内でウイルスRNAに特異的に結合し、速やかに細胞質に運び出すことで、ウイルスタンパク質の発現と複製を促進していると考えられてきた。しかし、細胞質に運び出されたウイルスRNAが、分解されずに選択的翻訳を受けられるメカニズムはまだ解明されていない。我々はRNAに結合し、ウイルス発現の制御をつかさどるRexが、これまで知られている以上に細胞内の経路に関わっていると予想し、まず初年度（H27年度）はRexと相互作用する哺乳類細胞内タンパク質を網羅的に同定することを試みた。その結果、Rexと特異的に相互作用するタンパク質81個を同定することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27年度は、「NMD抑制の分子メカニズム解明を目指したRexと宿主細胞内タンパク質の網羅的相互作用解析」を目標に研究を行った。NMDはUPF1、 UPF2、 UPF3B、 SMG1、 SMG5、 SMG6、 SMG7などのNMDコア・タンパク質が調和的に働くことにより、特にpremature termination codon (PTC)を持つ異常mRNAの検出と分解を行う経路である。PTCはスプライシング異常などによって生じる頻度が高い。また、PTCは翻訳の過程で検出されるため、NMDは遺伝子の転写、プライシング、翻訳、mRNA輸送などmRNAの代謝経路が直接的・間接的に関わる複雑な経路である。そこで本研究では、Rexによる細胞内経路への影響をより広範囲かつ網羅的に検討するため、MS解析によってRexと結合する宿主細胞内のタンパク質を網羅的に同定することを試みた。His-Halo-タンデムタグ付きRexを293FT細胞において過剰発現し、HisタグとHaloタグによる二重精製を行い、精製されたRexタンパク質と共沈してくる細胞内タンパク質をnanoLC-MS/MSシステムを用いて解析したところ、Rexに特異的に結合するタンパク質81個を同定することができた。この中には40S・60Sリボソームのサブユニットが多数含まれており、Rexがリボソーム自体と結合していることが予想された。前述したとおりNMDは翻訳と共役して起こる経路なので、Rexが翻訳の中心部分に相互作用している可能性は大変興味深い。またNMDコア・タンパク質とRexの相互作用を293FT細胞抽出液中でのGST-Rex-pulldown assayによって検討した。その結果、RexはUPF1,UPF3B, SMG5,SMG7など、NMD経路において必須の役割を果たすタンパク質群と相互作用することが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度に同定したRexと相互作用する81個のタンパク質について、主にIPA (Ingenuity Pathway Analysis)ソフトウェア(Qiagen)を用いてそれらのタンパク質の細胞内での機能を詳細に解析し、Rexが相互作用することによって、どのような影響が現れるのか予想する。特に注目すべき細胞内経路について、Rexがその経路内のタンパク質と実際に相互作用しているのかを、Rexとの共沈実験によって確認する。続いてRexが結合することにより、そのタンパク質の機能にどのような影響が生じるのか検討する。まずRexにEGFP、相互作用する細胞内タンパク質にmCherryなどの蛍光タンパク質を付加し、共焦点レーザー顕微鏡でRexの存在の有無による細胞内タンパク質の局在の変化を観察する。また、Rexの有無によるタンパク質の機能と活性への影響を調べる。この度Rexがリボソーム複合体と相互作用している可能性が強く示唆された。そこで細胞内リボソームを、ショ糖密度勾配法によってポリソーム（翻訳活性化状態）とモノソーム（翻訳非活性化状態）に分け、Rex存在・非存在下でポリソーム解析を行い、Rexが細胞全体の翻訳活性に影響するかどうか検討する。またRexがUPF1, UPF5, UPF7などのNMDコア・タンパク質群のリン酸化状態（活性状態）に与える影響を調査する。さらにNMDはUPF1-UPF2-UPF3Bのコンプレックス形成がトリガーとなるが、UPF3BがUPF3Aに置き換わると、NMDが抑制されることが知られている。そこで、RexとUPF3Bの相互作用がUPF1-UPF2-UPF3Bコンプレックスの形成に影響するか検証する。最後にRexの有無によって、NMD活性全体にどのような影響を与えているのかを、NMD活性レポーターアッセイ系などを用いて明らかにする。
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Research Products
(1 results)
