2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K06863
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| Research Institution | Research Institute, Osaka Medical Center for Cancer and Cardiovascular Disaeses |
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Principal Investigator |
岡本 三紀 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), 研究所, 研究員 (20332455)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | がん / 糖鎖 / 腫瘍マーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、臨床応用可能な新規腫瘍マーカーを探索することを目的とする。これまでに、がん患者および健常者血清から調整した糖鎖をHPLCで分離し、そのパターン比較から、がん患者に特異的なピークを腫瘍マーカー候補として、糖鎖構造の解析および定量を行ってきた。方法として、がん患者および健常者血清をヒドラジン処理により糖鎖を切り出し、さらにアミノピリジンで標識（PA化）する。ターゲットとする糖鎖構造に安定同位体である重水素（2H）標識したPA付加糖鎖を内部標準として、血清由来の1H 標識PA化糖鎖に一定量添加し、このPA化糖鎖mixtureを、順相および逆相カラムHPLCを用いて分離・精製、その後SRM（selected reaction monitoring）法を用いた３連四重極型質量分析計で相対定量し、この糖鎖構造が腫瘍マーカーとして有用であるか検討する。これまでにcore1 sialyl Lewis A構造を腫瘍マーカー候補として報告した他、core2構造を有する硫酸基付加されたO型糖鎖も同定している。さらに、本研究では、新規腫瘍マーカーとして硫酸基を含む微量酸性糖に着目した。血清中の糖鎖は、N-アセチルノイラミン酸(NeuAc)付加された酸性糖が大部分を占めているが、NeuAc以外の微量酸性糖も少なからず存在する。当研究室ではこれまでに、硫酸基が付加された糖鎖が主要成分である大腸がんの存在や、哺乳類ではその存在比率は極めて低いと考えられているdeaminoneuraminic acid(KDN)が付加されたN型の遊離糖鎖が蓄積した前立腺がんを報告した。そこで、硫酸基、KDNを含む酸性糖にフォーカスした新規の糖鎖腫瘍マーカー候補を探索し、臨床応用可能かどうか、がん患者血清を用いて検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
既に腫瘍マーカー候補として同定していた硫酸基付加O型糖鎖の構造は酵素消化、2次元糖鎖マッピング法および質量分析法により結合様式を含む糖鎖構造を決定した。さらに現在までに膵臓癌65名、胃癌146名、大腸癌101名、食道癌74名、健常者194名分の血清からヒドラジン処理により、糖鎖を抽出および蛍光ラベルを行った。この調整した糖鎖サンプルのうち血清10ul分に、内部標準として重水素（2H）標識した糖鎖を10fmol添加し、順相および逆相HPLCで分離、その後SRM法により質量分析で正確な定量を行った。同時に、NeuAcが付加されていない酸性糖にフォーカスを絞った新規糖鎖腫瘍マーカー探索を実施した。胃がん患者11名、膵がん患者9名および健常者20名の血清からPA化糖鎖を調整した後、N-アセチルノイラミニダーゼと反応させ、DEAEカラムにて酸性糖と中性糖に分離する。血清糖鎖での大部分を占めるNeuAc付加糖鎖は、この酵素処理により中性糖分画に溶出されるが、硫酸基やKDN付加された糖鎖はN-アセチルノイラミニダーゼには反応しないため、酸性糖領域に溶出される。この酸性糖分画に溶出された分画を濃縮後、順相および逆相クロマトグラムにかけ、がん患者、健常者間の分離パターンを詳細に比較し、がん患者特異的なピークを腫瘍マーカー候補として検索した。マーカー候補となるピークは、イオントラップ型質量分析装置を用いたLC/MS/MSで質量分析し、糖鎖の構造を推定した。またマーカー候補は、SRM法により40名の血清中の相対量も測定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
NeuAc以外の酸性糖に着目した新規腫瘍マーカー候補の糖鎖構造決定後、多数のがん患者および健常者の血清を高精度のSRM法による微量糖鎖定量を行い、臨床応用可能か評価する。マーカー候補となる糖鎖は結合様式を含む構造決定を行う。しかし血清中の糖鎖量のみでは糖鎖構造決定に至るには難しい。そこでがん組織、正常組織等に含まれる糖鎖から、順相および逆相HPLCの溶出時間が一致するフラクションを分離し、MSによりターゲット糖鎖と同じ糖鎖構造と思われる糖鎖を同定する。同定した糖鎖をもとに、詳細な糖鎖構造を、糖鎖構造特異的な酵素消化や2次元糖鎖マッピング法、質量分析法を組み合わせて決定する。得られた結果は、学会発表および論文投稿により報告する。
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| Causes of Carryover |
研究費は当初の計画通り、糖鎖構造解析および血清糖鎖調整における消耗品、学会参加費に使用した。研究計画も予定通り進行している。昨年度末、研究所の移転に伴い1ヶ月程度の実験停止期間があったが想定済みであったので、研究に影響を及ぼすことはなかった。しかし、移転あるいは機器の劣化のため、想定外の機器の故障があった。機器の修理費は申請書にも記載してあったが、高価備品の故障だったため、その修理あるいは購入のため（現在未決定）、消耗品費の節約を行っているが、最終年度は予算を全て使用予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
理由にも記載した通り、移転あるいは機器の劣化のため、想定外の高価機器の故障があった。しかし、助成金は主に消耗品費として使用する予定である。また学会発表および論文投稿費にも使用する。最終年度は予算を全て使用予定である。
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