2016 Fiscal Year Research-status Report
in vitro enChIP法の技術基盤の確立およびゲノム機能解析への応用
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15K06895
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤田 敏次 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (10550030)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ChIP / enChIP / in vitro enChIP / locus-specific ChIP / CRISPR / TAL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、これまでに、生体内でのクロマチン構造を保存したまま解析対象とするゲノム領域を単離する方法の一つとして、enChIP法（engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation）を開発してきた。enChIP法は、ゲノム編集技術で利用されているTALENテクノロジー（TAL蛋白質）やCRISPR系などの人工DNA結合分子のDNA認識領域を利用し、解析対象とするゲノム領域を細胞内でタグ付けした後、当該ゲノム領域を遺伝子座特異的に単離する方法論である。本申請課題では、人工DNA結合分子の細胞内発現を必要としない、in vitro enChIP法の技術基盤を確立する。具体的には、機能分子として精製した人工DNA結合分子と、細胞から抽出・断片化したゲノム複合体を、試験管内で混合後、アフィニティー精製することで、解析対象ゲノム領域を単離する技術を確立する。
これまでに、精製したTAL蛋白質を利用したin vitro enChIP法の可能性について検討を行ってきた。本年度は、精製したTAL蛋白質を利用したin vitro enChIP法の技術基盤の確立について検討を行った。その結果、カイコ発現系で準備した組換TAL蛋白質は分解が激しく、現時点では、精製TAL蛋白質をin vitro enChIP法へ利用することは難しいことが考えられた。次に、技術基盤が確立できたCRISPR系を利用したin vitro enChIP法を利用して、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAの網羅的同定を進めた。現在、in vitro enChIP法と次世代シーケンス解析を組み合わせることで、解析対象ゲノム領域と相互作用しているゲノム領域（エンハンサー領域など）の同定を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TAL蛋白質を利用したin vitro enChIP法の技術基盤の確立について検討を行った結果、TAL蛋白質は分解が激しく、CRISPR系と比較してin vitro enChIP法への利用が難しいことが考えられた。現在、技術基盤が確立できたCRISPR系を利用したin vitro enChIP法を利用して、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAの網羅的同定を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの実験から、CRISPR系を利用したin vitro enChIP法は、1%程度の効率で、解析対象ゲノム領域を単離できることが判明している。そこで、実験系（細胞数など）を最適化しつつ、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAを網羅的に同定する。
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| Causes of Carryover |
金額の端数
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
確立したin vitro enChIP法を利用し、解析対象ゲノム領域に結合している分子を同定する。
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