2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of in vitro enChIP and its applications to analysis of molecular mechanisms underlying genome functions
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15K06895
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
藤田 敏次 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい准教授 (10550030)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ChIP / enChIP / in vitro enChIP / locus-specific ChIP / CRISPR / TAL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、これまでに、生体内でのクロマチン構造を保存したまま解析対象とするゲノム領域を単離する方法の一つとして、enChIP法（engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation）を開発してきた。enChIP法は、ゲノム編集技術で利用されているTALENテクノロジー（TAL蛋白質）やCRISPR系などの人工DNA結合分子のDNA認識領域を利用し、解析対象とするゲノム領域を細胞内でタグ付けした後、当該ゲノム領域を遺伝子座特異的に単離する方法論である。本申請課題では、人工DNA結合分子の細胞内発現を必要としない、in vitro enChIP法の技術基盤を確立する。具体的には、機能分子として精製した人工DNA結合分子と、細胞から抽出・断片化したゲノム複合体を、試験管内で混合後、アフィニティー精製することで、解析対象ゲノム領域を単離する技術を確立する。
これまでに、精製したTAL蛋白質やCRISPR系を利用したin vitro enChIP法の可能性について検証を行ってきた。その結果、精製CRISPR分子がin vitro enChIP法に適していることが判明した。次に、技術基盤が確立できたCRISPR系を利用したin vitro enChIP法を利用し、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAの網羅的同定を進めた。in vitro enChIP法と次世代シーケンス解析を組み合わせることで、標的ゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができた。さらに、標的ゲノム領域に存在する遺伝子の発現制御を担うエンハンサー領域を同定することも成功した。
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[Journal Article] Promoter-associated proteins of EPAS1 identified by enChIP-MS - A putative role of HDX as a negative regulator2018
Author(s)
Hamidian Arash, Vaapil Marica, Stedingk Kristoffervon, Fujita Toshitsugu, Persson Camilla U., Eriksson Pontus, Veerla Srinivas, De Preter Katleen, Speleman Frank, Fujii Hodaka, Pahlman Sven, Mohlin Sofie
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Journal Title
Biochemical and biophysical research communications
Volume: 499
Pages: 291-298
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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