2016 Fiscal Year Research-status Report
リプログラミング技術を利用した細胞老化のエピゲノム解析
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15K06900
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
三好 浩之 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任准教授 (70219830)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞老化 / リプログラミング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞老化は、DNA損傷、酸化ストレス、癌遺伝子発現などのストレスによって誘導され、不可逆的に細胞分裂が停止する現象であるが、その分子機構はまだ不明な点が多い。本研究では、分裂停止した老化細胞からiPS細胞を樹立し、老化前の細胞由来iPS細胞や元の老化細胞との間で、遺伝子発現レベル、エピジェネティックな変化、細胞周期や細胞機能などの性状を比較解析することにより、細胞老化の分子メカニズム解明の新たな糸口を見いだすことを目的としている。
平成27年度に、分裂能を完全に失い老化した正常ヒト新生児皮膚由来線維芽細胞(NB1RGB)から、リプログラミング因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28)に加えSV40LTを一過性に発現させ、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤とヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を添加することにより、非常に低い頻度ではあるがiPS細胞を樹立することができた。平成28年度は、老化した正常ヒト胎児肺由来線維芽細胞(TIG1)からも同様にして非常に低い頻度でiPS細胞を樹立することができた。老化細胞由来iPS細胞の増殖や形態は、50回以上継代を重ねても、老化前の細胞由来iPS細胞と変わらなかった。網羅的遺伝子発現、DNAメチル化、ヒストン修飾の比較解析においても差はほとんど見られなかった。また、iPS細胞から線維芽細胞へ分化誘導し、継代培養後の細胞老化についても差は見られなかった。これらのことから、エピジェネティックな変化によって細胞は老化するが、リプログラミングによって分裂停止した老化細胞は若返ることができると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分裂能を完全に失い老化した正常ヒト新生児線維芽細胞(NB1RGB)および正常ヒト胎児肺由来線維芽細胞(TIG1)に、染色体に組み込まれないレンチウイルスベクターによってSV40LTを一過性に発現させ、さらにリプログラミング因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28)をレンチウイルスベクターによって導入し、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(RG108)とヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤(BIX01294)を添加することにより、非常に低い頻度(0.0000026～0.00001%)ではあるがiPS細胞を樹立することができた。iPS細胞の樹立は、未分化マーカー(SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81)の発現を免疫染色法により確認し、多能性の確認は免疫不全マウスへの移植によるテラトーマ形成(三胚葉系への分化能力)により行った。老化細胞由来iPS細胞の増殖や形態は、50回以上継代を重ねても、老化前の細胞由来iPS細胞と変わらないことが確認された。マイクロアレイとRNA-Seqによる網羅的遺伝子発現解析、イルミナ社のHumanMethylation27 BeadChipを使用したゲノム全領域で27,578のCpGサイトのDNAメチル化解析、H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3の抗体によるクロマチン免疫沈降シークエンス(ChIP-Seq)によるゲノムワイドのヒストン修飾解析でも、両者で差はほとんど見られなかった。また、iPS細胞から線維芽細胞へ分化誘導した後の分裂寿命（細胞老化）についても差は見られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
網羅的遺伝子発現解析およびエピゲノム解析の結果、老化細胞由来iPS細胞と老化前の細胞由来iPS細胞との間で差はほとんど見られなかったが、同様の比較解析を分裂停止した老化線維芽細胞と老化前の線維芽細胞についても行い、老化前後のヒストン修飾状態およびDNAメチル化状態と遺伝子発現の関係をゲノムワイドに掌握し、細胞老化に関わる未知の遺伝子発現変化を探索する。また、分裂能を失い老化した線維芽細胞からのiPS細胞の樹立効率が極めて低かったことから、樹立できたiPS細胞はまだ完全には老化していなかった細胞に由来する可能性が否定できない。そこで、老化線維芽細胞とiPS細胞との細胞融合を行い、4倍体のiPS細胞の樹立を試みることにより、老化細胞のリプログラミング効率について検証する。
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| Causes of Carryover |
研究成果を学会で発表するため旅費を計上したが、発表に至らなかったため旅費を使用しなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度は、分子生物学会等の学会に参加し発表するため、旅費を使用する予定である。
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