インスリン遺伝子特異的なエピジェネティック制御に基づく膵β細胞障害の定量法の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06910
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 黒田 暁生 徳島大学, 先端酵素学研究所(糖尿病), 准教授 (70571412)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松久 宗英 徳島大学, 先端酵素学研究所(糖尿病), 特任教授 (60362737) ; 田蒔 基行 徳島大学, 先端酵素学研究所(糖尿病), 特任助教 (60624400)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: インスリン遺伝子 / エピジェネティック制御 / bisulfite処理 / ARMS法 / PCR

Outline of Annual Research Achievements

1.　膵β細胞のDNAメチル化特性 Genomic DNAのC:シトシン、G:グアニンというCpG配列と呼ばれるCG配列がDNAのメチル化により転写を調節する。生体内で膵β細胞のみが、血糖値を低下させるインスリンを分泌する。1型糖尿病では、膵β細胞が選択的に破壊され、その結果インスリン分泌不足となり血糖値が上昇する。インスリン遺伝子では特異的なCpGが存在し、この配列がメチル化されていない（脱メチル化）場合にその転写は開始して、逆にメチル化されていると転写が消失する。
2.　制限酵素処理後のPCRでの膵β細胞由来DNAの検出　DNAはBisulfite（B）処理によって1本鎖DNAとなり、β細胞を表す脱メチル化CpGはT（チミジン）Gへ、非β細胞を表すメチル化CpGはCGに留まる。B処理した1本鎖DNAのインスリン遺伝子周辺をPCRで増幅したDNAは2本鎖となる。それぞれ特異的な3か所のCG配列を認識するHpy188I、HinfI、AciIはこの2本鎖DNAを切断する。これら制限酵素を同時に用いてインスリン遺伝子のB処理後と同じ配列のプラスミドを濃度に応じた検出を検討した。非膵β細胞と同じ配列の中に膵β細胞と同じ配列を1%含有するサンプルまでは濃度依存性増幅が認められたが0.1%と0%の濃度差は検出できなかった。
3.　ARMS法を用いたPCR　 Amplification-refractory mutation system (ARMS)法とは3’末端の1塩基の違いを見出し、遺伝子変異を検出する方法である。膵β細胞を表すTGであるときのみPCRが増幅するARMS法を作った。両側のPCRプライマーの3’末端にARMS法を用いたPCRでは膵β細胞を表すプラスミドでは10コピーでPCRが陽性となる濃度と非β細胞を表すプラスミド109コピーが同等にPCRで増幅できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度のメチル化特異的制限酵素McrBCはメチル化特異的DNAを切断する制限酵素であるが、これを用いた検討では酵素活性が不十分であった。このため新たな実験系の樹立を行った。
進捗状況に述べたように、より強い活性をもつHigh Fidelity型の制限酵素であるHpy188I、HinfI、AciIを用いた方法ではMiSeqを用いた方法とも完全に一致した結果を示したが、低い濃度での定量性が確立できなかった。
このほかPCRを用いたCpG配列の脱メチル化を検出する方法として、RNaseH PCRの原理を活かしたrhPCRプライマーを用いて外側のCpGの脱メチル化を検出してCycleaveプローブを用いて中心となるCpGの脱メチル化を特異的に検出する方法を検討したがPCR酵素が合わなかったためか作動しなかった。
PCR効率のより高度であること、系が作動することを念頭に制限酵素による検討から視点を移して、ARMS法を行ったところ上述のように脱メチル化CpGをきわめて特異的にPCRで増幅させることが可能となった。現在これを用いたPCRの系の樹立を精力的に行っているところである。

Strategy for Future Research Activity

ヒトインスリン遺伝子の遺伝情報転写開始より下流にも膵β細胞特異的に脱メチル化が保たれたCpGが多数存在していることが2016年に報告された（Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E1826-34)。なかでもヒトインスリン遺伝子エクソン2のインスリン転写開始から+367,+374,+401,+404bpに位置する部位にCpG配列が存在しており、CpG脱メチル化が膵β細胞のみで保たれている。このためこの領域を目的領域として+367, +404bpのCpGで第1回目の、+374,+401bpのCpGで第2回目のARMS法によるPCRを行うことを目的に検討する。
血清中の遊離DNAを分離抽出して分離抽出条件、遊離DNA のB処理の最適化、B処理後のサンプルのPCRのための使用PCR酵素の検討、PCR条件を整えることを検討する。健常人サンプルでPCRで増幅されないことを確認する。
1型糖尿病の膵β細胞傷害を表す指標はない。1型糖尿病の根治療法として、膵臓あるいは膵島移植が実施されており、慢性拒絶反応が長期成績を規定する。しかしこの反応を直接証明する方法はない。細胞死により放出される遊離DNAを用いて膵β細胞特異的なインスリン遺伝子の脱メチル化状態から、膵β細胞傷害の定量化できるかどうかを今年度中に1型糖尿病患者サンプルを用いて定量化することを開始する。そして1型糖尿病での陽性陰性カットオフ値を設定する。