性分化関連遺伝子におけるポリコーム標的ゲノム領域の機能解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K06917
• Research Institution: National Center for Child Health and Development
• Principal Investigator: 福井 由宇子 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, その他部局等, 研究員 (50342639)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高田 修治 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (20382856)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: クロマチン / 性分化

Outline of Annual Research Achievements

染色体クロマチン構造がダイナミックに変化する細胞分化過程において、Polycomb Group (PcG) 遺伝子は主要なクロマチン構成制御因子である。本研究課題では、生殖腺マスター遺伝子を制御するPcG メンバーCbx2に焦点をあて、これまでの技術を基に、微量なマウス胚細胞を用いたクロマチン免疫沈降 (ChIP)-sequencingをおこなう。得られた結果からCbx2標的ゲノム領域を同定する。さらに、効率的CRISPR/Cas9ゲノム編集システムにより作製する標的ゲノム領域欠失マウスの解析により、空間・時間を反映した個体レベルでの標的ゲノム領域の機能検証をおこなう。研究成果はヒト性分化疾患発症機序解明に新たな解析対象を提示する可能性がある。Cbx2は性分化・生殖腺分化に必須であることが明らかにされている唯一のPcG構成因子であり、ヒトにおいても46, XY complete gonadal dysgenesisタイプの DSD患者にCBX2機能変異が報告されている (Biason-Lauber et al., Am. J. Hum. Genet., 2009)。以上のようにCbx2は哺乳類における生殖システム構築の根幹に関わる重要な因子である。本研究では、性分化・生殖腺分化に必須なクロマチン因子Cbx2を手がかりに、性分化・生殖腺分化クロマチンレベルのマスター遺伝子制御機構を明らかにする。昨年度から本研究を開始したが、性分化過程を反映する適切な培養細胞系がないことから、生殖腺分化前の生殖腺および生殖腺分化後の生殖腺/中腎を用いて行なっている。生体内で構築過程の生殖腺を用いることで、空間と時系列を考慮した組織構築分子機構を解明できる。Cbx2抗体は既に独自に作製しており、Cbx2発現量の低いMEFを用いた予備実験では、解析限界を超える沈降DNAを回収した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス胎児生殖腺を実体顕微鏡下で中腎領域と分離して遺伝子発現解析が可能であることを確認した。これまでgene expression arrayでマウスポリコームCbx２ノックアウト性腺で発現変動のある遺伝子の発現変化を検証した。さらに当時gene expression arrayでは検討していなかったが、近年性分化に関わると予想されているnon-coding RNA、splycing variantの発現変動も検証した。ChIP-seq解析は１回の実験が高額であることから、条件検討を充分に行なっている。一度に得られる組織細胞量が生殖腺分化前の雌雄胎生10.5日中腎を含む予定生殖腺および生殖腺分化後の雌雄胎生11.5日生殖腺/中腎 では10000～50000個と非常に少ないが、生殖腺組織を固定後集積し保存する方法を確立した。マウスのゲノム編集のための技術は多くの遺伝子領域において効率的に安定して行なえることが昨年度中に明らかになった。

Strategy for Future Research Activity

Cbx2 の標的であるCpG Islandの特性を明らかにする。ChIP- Seq実験は、充分なリードを得ることを目指す。より予算的負担の少ない方法も検討する。

Causes of Carryover

サンプル調整用キットの変更により金額が変動しました。

Expenditure Plan for Carryover Budget

新たな条件検討を行なうため動物、試薬を購入予定。

Research Products

• [Journal Article] Lack of Skeletal Dysplasia in Patients with Missense Mutations and Upstream Deletion of SOX9. (2015)
  • Author(s): Katoh-Fukui Y, Igarashi M, Nagasaki K, Horikawa R, Nagai T, Tsuchiya T, Suzuki E, Miyado M, Hata K, Nakabayashi K, Hayashi K, Matsubara Y, Baba T, Morohashi K, Igarashi A, Ogata T, Takada S, and Fukami M
  • Journal Title: Molecular Genetics & Genomic Medicine Volume: 3 Pages: 550-557
  • DOI: doi: 10.1002/mgg3.165.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular basis of non-syndromic hypospadias: systematic mutation screening and genome-wide copy-number analysis of 62 patients. (2015)
  • Author(s): Kon M, Suzuki E, Dung VC, Hasegawa Y, Mitsui T, Muroya K, Ueoka K, Igarashi N, Nagasaki K, Oto Y, Hamajima T, Yoshino K, Igarashi M, Kato-Fukui Y, Nakabayashi K, Hayashi K, Hata K, Matsubara Y, Moriya K, Ogata T, Nonomura K, Fukami M.
  • Journal Title: Hum Reprod. Volume: 3 Pages: 499-506
  • DOI: doi: 10.1093/humrep/deu364.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] マウスポリコームCbx2/M33ノックアウトマウスにおける頭蓋冠形成異常 (2015)
  • Author(s): 福井由宇子・津村秀樹・深見真紀
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市
  • Year and Date: 2015-12-03 – 2015-12-03
• [Presentation] Vanishing Testis SyndromeにおけるDSD関連遺伝子の網羅的変異解析 (2015)
  • Author(s): 福井由宇子・五十嵐麻希・長崎啓祐・位田忍・堀川玲子・鈴木江莉奈・宮戸真美・中村明枝・緒方勤・深見真紀
  • Organizer: 第49回日本小児内分泌学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京都江戸川区
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-08
• [Presentation] Mouse Polycomb Cbx2 Plays Essential Roles in Postnatal Bone Formation (2015)
  • Author(s): Y. Katoh-Fukui, T. Baba, H. Otake, T. Sato, M. Suyama, Y. Ohkawa, K. Morohashi, H. Tsumura and M. Fukami
  • Organizer: Mouse Molecular Genetics 2015
  • Place of Presentation: Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK
  • Year and Date: 2015-09-18 – 2015-09-18
  • Int'l Joint Research