2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト人工染色体を利用した迅速な巨大ゲノム領域のクローニングおよび他細胞への移植
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15K06927
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| Research Institution | Kazusa DNA Research Institute |
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Principal Investigator |
長谷川 嘉則 公益財団法人かずさDNA研究所, バイオ研究開発部, チーム長 (30387683)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヒト人工染色体 / 巨大ゲノム領域 / クローニング / ベクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム解読の進展に伴い、「制御領域全体を含んだ巨大な遺伝子領域を対象とした発現解析」や「リボソームRNA反復配列（rDNA）のように大きな非コードDNA領域を含む巨大反復配列等の長大なゲノムDNA領域の機能解析」が重要性を増している。しかし、巨大ゲノム領域のクローニングは非常に困難であり、たとえ成功したとしても結果的に多くの時間を費やしてしまう。私は、導入DNAのサイズに制限がないヒト人工染色体（HAC）ベクターとCRISPR/Cas9システムを利用することによって、1. 巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでを僅か２ヶ月で完了させる方法を確立する。さらに、この方法の有用性を示すために、ヒト巨大ゲノム領域をHACベクターへ搭載後、マウスES細胞へトランスファーを行い、トランスジェニックマウスを作製する。
平成28年度は、制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上に達する目的の遺伝子（Gene of interest, GOI）をHACベクターへ挿入後、GOI搭載HACベクターをマウスES細胞を含む様々な細胞へトランスファーすることを目標とした。総DNA長が600kb以上のGOIについてHACベクターへの搭載が完了したので、ヒト培養細胞、齧歯類培養細胞へトランスファーを行った。その結果、試した全ての細胞においてトランスファーに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度は、制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上に達する目的の遺伝子（Gene of interest, GOI）をHACベクターへ挿入後、GOI搭載HACベクターをマウスES細胞を含む様々な細胞へトランスファーすることを目標とした。HACベクターへのGOIの搭載が完了したので、ヒト培養細胞、齧歯類培養細胞へトランスファーを行ったところ、全ての細胞においてトランスファーに成功した。本課題の目的はほぼ達せられたと言える。しかし、この２年の間のトランスジェニックマウスを利用した研究の進展をみると、作製したGOI搭載HACベクターの遺伝子は、トランスジェニックマウスを作製しても研究上の発展が見込めないものとなった。そこで、この遺伝子とは異なる遺伝子を搭載したHACベクターを使用して、マウスES細胞へトランスファーを行うことに変更した。現在、本課題において確立した方法を用いて、迅速にHACベクターへの搭載を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
新たに、制御領域を含んだ総DNA長が数百kb以上に達する遺伝子搭載HACベクターの作製を進めている。本課題の成果により、巨大ゲノム領域の迅速なクローニングが可能となったので、マウスES細胞へのトランスファーを行った後、GOI搭載HACベクター保有トランスジェニックマウスの作製まで最終年度に間に合う見込みである。
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