2017 Fiscal Year Annual Research Report
Rapid clonig and transfer of a huge genome DNA using human artificial chromosome
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15K06927
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| Research Institution | Kazusa DNA Research Institute |
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Principal Investigator |
長谷川 嘉則 公益財団法人かずさDNA研究所, バイオ研究開発部, チーム長 (30387683)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 巨大DNA / クローニング / ヒト人工染色体 / Slox / Vlox / 部位特異的組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
導入DNAのサイズに制限がないヒト人工染色体（Human Artificial Chromosome, HAC）ベクターとCRISPR/Cas9システムを利用することによって、1. 巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでを僅か２ヶ月で完了させる方法を確立することを目標とした。方法として、巨大ゲノム領域挿入のために部位特異的組換えサイトであるVLoxサイトとSLoxサイトが挿入されたHACベクター保有ヒト細胞において、CRISPR/Cas9システムを利用して、制御領域を全て含んだ数百kb以上の目的の標的遺伝子（GOI）の両側にVLoxサイトとSLoxサイトを挿入したのち、VCre酵素とSCre酵素を同時に発現させて、部位特異的組換えにより、GOIをHACベクターへ挿入した。CRISPR/Cas9システムを利用した反応条件の最適化により、GOIの両側へのVLoxサイトとSLoxサイトの挿入効率を上げることができた。しかし、その効率は、細胞種毎に大きく異なった。その後のHACベクターへの目的遺伝子の挿入では、細胞種間での効率には差が少なく、総DNA長が600kb以上のGOIについても成功した。GOI搭載HACベクターの、他細胞へのトランスファーには、試した細胞種全てにおいて成功した。ホスト細胞種を選択することにより、1. 巨大ゲノム領域のHACベクターへのクローニング、2.巨大ゲノム領域搭載HACベクターの目的細胞へのトランスファーまでの工程を２ヶ月で完了させることは十分可能であった。
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