2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒトORCのグアニン四重鎖結合活性の複製開始点形成における役割の解明
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15K06956
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| Research Institution | Japan Women's University |
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Principal Investigator |
和賀 祥 日本女子大学, 理学部, 教授 (60222402)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 複製開始点 / グアニン四重鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
どのような仕組みによって高等真核生物の複製開始点が染色体DNA上の特定の領域に規定されるのかを明らかにすることを目標に、複製開始点に結合するタンパク質であるORCの解析を進めた。
ヒトORCのサブユニットの１つであるORC1はグアニン四重鎖構造を取り得る配列（G4モチーフ）をもつRNAや一本鎖DNAに優先的に結合する活性を有する。これまでにORC1のアミノ末端側の領域が同活性を担うことが明らかになっており、今年度はこの領域と一本鎖DNAとの相互作用の詳細な解析を進めた。連携研究者である片平正人博士（京都大学）による協力を得て、NMRによる解析を進めた結果、G4構造にORC1ドメインが結合することが確認できた。さらに、ORC1ドメインとの相互作用に関わるG4構造中の残基を推定することができた。この結果は、ORCのG4構造に結合する生物学的な意義を理解する上で重要な知見である。
NMR解析と合わせて、ORC1のG4モチーフ結合ドメインの結晶構造決定に向けたタンパク質調製を進めた。しかし、大腸菌における発現量の低さ、短鎖のポリペプチドの混入およびタンパク質の不溶化という問題に直面し、期待通りの成果は得られていない。別項で記述するようにこの解析は改善を加えつつ来年度も継続する。
当初の実施計画にあったように、変異ORC1のヒト細胞への導入に伴うDNA複製の影響の解析も行った。まず初めにORC1のG4モチーフ結合ドメインの過剰発現に伴う影響をヌクレオチドアナログのDNAへの取り込み量の解析から調べた結果、発現によって細胞のDNA複製活性が低下する傾向が認められた。この結果は、同結合ドメインがDNA複製の何れかのステップを阻害している可能性を示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ORC1とG4との相互作用に関する構造生物学的な解析において、NMRを利用した解析は概ね順調に進んでいる。しかし、結晶構造解析の方は結晶作製に必要はタンパク質量を得るには至っておらず、進行は遅れている。
細胞を用いた解析もORC1ノックダウンの条件も確立し概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究実施計画の通りに推進していく予定である。
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| Causes of Carryover |
９月に参加予定であった国際会議の開催時期が他の業務と重なったために参加できなくなり、次年度以降の国際会議で発表することとしたため。また、次年度以降、当初の計画よりもスケールを大きくした細胞培養を行って細胞を使った解析を進める必要がでてくる可能性が考えられたため、物品費の一部を来年度に支出することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
国際学会への成果発表の旅費と使用する予定である。細胞培養で使用する血清の購入で物品費を支出する予定である。
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