2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒトORCのグアニン四重鎖結合活性の複製開始点形成における役割の解明
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15K06956
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| Research Institution | Japan Women's University |
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Principal Investigator |
和賀 祥 日本女子大学, 理学部, 教授 (60222402)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA複製 / ORC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、どのような仕組みによって高等真核生物の複製開始点が染色体DNA上の特定の領域に規定されるのかを明らかにすることを目標に、複製開始点に結合するタンパク質であるORCの解析を進めた。
ORC1サブユニットのN末端側半分の領域にG-rich RNA/１本鎖DNA（ssDNA）に優先的に結合する活性を有するドメインがあるが、その結晶構造を決定すべく、同領域の精製を昨年より進めてきた。しかし、不溶化の問題が解決できず、思うようには進展していない。
一方、ORC1のN末端側半分の領域をヒト培養細胞で発現させると、S期細胞の割合が有意に減少することを見出した。さらに、クロマチン結合活性を有するBAHドメインやHP1結合ドメインを欠いたN末端側領域を細胞で発現させ、その局在を調べた結果、既知のクロマチン結合ドメインを欠いたにも関わらず、依然としてクロマチン局在が認められた。この結果は、G-rich RNA/１本鎖DNA（ssDNA）結合活性が、クロマチン結合に関与する可能性を示唆する。
また、我々はこれまでに、ORC1のN末端側領域のG-rich RNA/１本鎖DNA（ssDNA）結合活性を低下させるアミノ酸置換変異の同定に成功している。この変異を導入したORC1を細胞で発現させ、その局在を調べた結果、正常型ORC1の局在とは全く異なる局在を示した。その局在は、N末端側領域を欠損させたORC1の局在と似たものであった。以上の結果は、ORC1のN末端側半分の領域がもつG-rich RNA/１本鎖DNA（ssDNA）結合活性が、ORC1の本来のクロマチンへの結合に関与することを強く示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
G-rich RNA/１本鎖DNA（ssDNA）結合活性を低下させるアミノ酸置換変異を導入したドメインを有するORC1の細胞内の局在が、正常型に比べて大きく変化したことを見出したことは大きな成果であり、この点において進展したと判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今まで通り、精製した変異ORCやORC1ドメインの活性を生化学的に調べていくとともに、変異ORCやORC1ドメインを細胞で発現させ、in vivoでの解析を推進していく。
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| Causes of Carryover |
DNA組換え実験および大腸菌での過剰発現実験などで使用する冷却装置付き振とう培養器が老朽化し、交換が必要になった。そのため、次年度の予算と合わせて購入することを、急遽計画したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の培養器の購入する予定である。
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