2016 Fiscal Year Research-status Report

リボソーム触手様タンパク質とアミノアシルtRNA合成酵素の相互作用の構造基盤解明

Research Project

Project/Area Number	15K06964
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	伊東孝祐新潟大学, 自然科学系, 助教 (20502397)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	三好智博新潟大学, 研究推進機構, 助教 (60534550)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	リボソーム / 触手様タンパク質 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 翻訳 / X線結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements	リボソーム表面で柔軟かつ広範囲に運動する“触手様タンパク質”は、翻訳因子と直接相互作用して翻訳因子をリボソームへとリクルートする役割を担う。我々はこれまでに、触手様タンパク質と翻訳伸長因子の相互作用の構造基盤を明らかにしてきた。一方で最近、触手様タンパク質が、翻訳因子とは構造も機能も全く異なるアミノアシルtRNA合成酵素とも相互作用し、アミノアシルtRNAを翻訳因子へ効率よく供給する役割も担うという、タンパク質合成の新たな仕組みが明らかになった。そこで本研究では、我々のこれまでの実験基盤を利用し、触手様タンパク質・アミノアシルtRNA合成酵素複合体の構造を明らかにすることを目的とした。触手様タンパク質はフレキシブルな構造を有しているため、そのままの状態では結晶化が困難である。そのため本年度は、まず、結晶化に適した構造が安定な触手様タンパク質断片を作製することを目的とし、触手様タンパク質におけるアミノアシルtRNA合成酵素との相互作用部位の特定を行った。相互作用部位の特定は、触手様タンパク質の削除体を数種作製し、蛍光偏光度測定法により行った。その結果、触手様タンパク質はC末端ドメインのN末端領域でアミノアシルtRNA合成酵素と相互作用していることが明らかになった。この結果は意外な結果であった。なぜなら、我々はこれまでに、触手様タンパク質はC末端ドメインのC末端領域で翻訳因子と相互作用することを突き止めていたからである。次に我々は、アミノアシルtRNA合成酵素との相互作用部位を含む触手様タンパク質ペプチドとアミノアシルtRNA合成酵素の共結晶化に取り組んだ。結晶化のスクリーニングはシッティングドロップ蒸気拡散法により行った。その結果、現在までに針状結晶を得ることに成功している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 触手様タンパク質とアミノアシルtRNA合成酵素の相互作用は弱く、その検出は予想以上に困難であったが、上記の如く我々は蛍光偏光度測定法により、触手様タンパク質はC末端ドメインのN末端領域でアミノアシルtRNA合成酵素と相互作用していることを示した。また、我々は、アミノアシルtRNA合成酵素との相互作用部位を含むペプチドとアミノアシルtRNA合成酵素の共結晶化に取り組み、針状結晶を得ることに成功している。よって、研究はおおむね順調に進んでいると判断した。
Strategy for Future Research Activity	今後は、触手様タンパク質のC末端ドメイン以外の部分がアミノアシルtRNA合成酵素との相互作用に関与しているかを蛍光偏光度測定法により追究する。また、触手様タンパク質とアミノアシルtRNA合成酵素の共結晶化について、さらに結晶化条件の精密化を行い、よりX線回折実験に適した結晶の取得を目指す。
Causes of Carryover	当初、結晶化が旨く行かなかった場合は様々な合成ペプチドを試みる予定であったが、はじめに用意したペプチドによる結晶化スクリーニングにより結晶が出現したので、多種類のペプチドを合成する必要がなくなり、その分支出が抑えられた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度は、触手様タンパク質の削除体の調製および結晶化を行う際に、試薬類に100万円、ガラス・プラスチック器具類に50万円が必要となる。また、結晶が構造解析をするに値するまで改良できなかった際には、更に異なるペプチドを試す。ペプチドの化学合成は専門の業者に外部委託するので、これに30万円の予算を計上する。回折強度データの収集は高エネルギー加速器研究機構（筑波）で行うが、このための旅費として18万円の予算を計上する（3万円 x 2人分 x 3回 = 18万円）。研究成果を学会で発表するための旅費として12万円が必要となる（第40回日本分子生物学会年会、神戸、3泊4日）。