2015 Fiscal Year Research-status Report
生体を模倣する試験管内アミロイド線維形成反応系の構築と反応機構の解析
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15K06965
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
長谷川 一浩 福井大学, 医学部, 助教 (60324159)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内木 宏延 福井大学, 医学部, 教授 (10227704)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 変性とフォールディング / 病理学 / アミロイド / アルツハイマー病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
難治性疾患であるアミロイド症を引きおこす各種アミロイド線維、特にアルツハイマー病βアミロイド(Aβ)およびβ2-ミクログロブリン(β2-m)アミロイド(透析アミロイド)に焦点を当て、生体内環境を忠実に模倣した試験管内アミロイド線維形成反応系を構築する。これを用いて、生体内のアミロイド線維形成過程での前駆体蛋白質や生体分子等の相互作用を再現して反応機構全体を解明し、治療法の探索に用いることを目的とする。特にAβアミロイドでは生理濃度(nM)に近いAβ蛋白質(ペプチド)モノマー濃度で重合反応を行う開放型反応系を構築し、従来の高濃度の前駆体蛋白質を用いたのではわからない共存蛋白質などとの相互作用を直接解析することを現在の課題としている。
本年度の成果：Aβアミロイド。測定の濃度範囲・感度を向上するための検出器の改善を行った。また、開放型反応系に、脳脊髄液中の生理濃度の血清アルブミンを共存させたところ、血清アルブミンは従来の文献で報告されているよりも強くAβ蛋白質と相互作用している可能性が示された。今後検証を行う。β2-mアミロイド。アミロイド線維形成が重合核依存重合機構で行われるとすれば、重合核の形成を誘起する生体物質が存在するはずであり、それを試験管内で探索する反応系の構築を開始した。今回は閉鎖型反応系を用いて検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(a) Aβアミロイド線維形成反応系の検討。
開放型Aβアミロイド線維形成反応系の基本型の構築；現在構築中の反応系では、反応容器に評価したい蛋白質を固定化した担体を入れ、低濃度のAβ40蛋白質溶液を添加する。アミロイド線維に特異的な蛍光物質であるチオフラビンTの蛍光を測定し、線維を定量している。現在は基本反応系を検討するため、Aβアミロイド線維(fAβ)を担体に固定して、そこにAβ蛋白質を添加し、線維の伸長反応を観察した。今回、従来よりも高性能の測定器を用いることで測定の安定度が改善された。また、この際に共存させた血清アルブミンはAβ蛋白質と予想より強く結合している可能性が示された。この現象は、開放型反応系を用いて反応させるAβ蛋白質濃度を低下させたために初めて顕在化したものと考えられる。
(b) β2-mアミロイドの検討。β2-mアミロイドでは、線維形成・伸長の際に前駆体蛋白質β2-mを脂肪酸、リゾリン脂質などにより部分変性する必要がある。平成２９年度に行う予定にしていた脂肪酸などの作用機序を解析する一環として、Aβアミロイドに用いたと同様な閉鎖型反応系を構築した。生体分子により核形成が誘起されることを検出するための反応系である。この結果、生体分子間相互作用を検出するためには、反応条件などに関して、より詳細な検討が必要であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
(a) Aβアミロイド線維形成反応系の検討。２８年度は、開放型Aβアミロイド線維形成反応系の基本型を確立する。２７年度示された、脳脊髄液中に最も多い蛋白質である血清アルブミンの線維伸長反応に対する効果の検討などを行うことで、基本反応系を構築する。ついで、トランスサイレチン(TTR)、アポリポ蛋白質E(apoE)等の脳脊髄液中の蛋白質群の効果を解析する。次いで、当初計画を順次検討する。順に、低濃度Aβ蛋白質モノマーとHSA, TTR, apoEなどの各種蛋白質の結合と競合するリガンドの検出。脳中の生理濃度である1 nMオーダーで線維が重合・伸長するかどうかを確認する。核形成を誘起する因子を探索する; 細胞外マトリックス成分などを担体に固定して、1から10 nM程度のなるべく低濃度のAβ蛋白質を添加し、核形成を促進し線維を形成させる因子を見出す。Aβ蛋白質の凝集を生体内において阻止しうる薬剤の探索等を行う。
(b) β2-mアミロイド線維形成反応系の検討(平成２９年度の予定)。β2-mアミロイドについて生体を模倣する試験管内アミロイド線維形成反応系を構築する。この際、脂肪酸やリゾリン脂質の生体内濃度範囲内で線維形成伸長を観測できる反応系を構築する。また、この反応系の構築にあたって、沈着局所の細胞外マトリックス成分(プロテオグリカン等) 等が線維形成の相乗効果を示すかを検討し、その結果を反応系に組み込む。これにより、生体内でβ2-mを部分変性させる線維伸長因子の確定を試みる。ついで、この反応系を用いて線維形成を阻害する薬剤を探索する。
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| Causes of Carryover |
開放型Aβアミロイド線維形成反応系の基本型の構築において、血清アルブミンはAβ蛋白質と予想より強く結合している可能性が示された。それとともに、反応系の検討を行う必要が生じた。このため、当初計画していた反応システムの増設を当該検討終了まで保留することが妥当となった。従って、交付申請書に記載した反応機器などの備品や関連する消耗品類の購入を保留したために次年度使用額の大半が生じたものである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
開放型Aβアミロイド線維形成反応系の基本型の構築において、上記の反応機器ならびに関連する消耗品を購入する。また、構築した開放型反応系を用いたAβ蛋白質と共存蛋白質の相互作用解析と、Aβ蛋白質の凝集を阻止する薬剤の探索について下記の物品の購入に使用する。すなわち、市販のAβ蛋白質並びに当該蛋白質（TTR,aopEなど）、蛋白質を作成するための遺伝子操作に関連する消耗品、および、相互作用を解析するための酵素免疫測定法等に必要な消耗品などである。
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Research Products
(1 results)
