2016 Fiscal Year Research-status Report
核磁気共鳴法を利用した高分子量蛋白質の定量的な動態解析法の開発
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15K06966
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
宮ノ入 洋平 名古屋大学, 理学研究科, 特任助教 (80547521)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | NMR / 蛋白質 / 動態 / 安定同位体標識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質の高次生命機能を解明するためには、その立体構造だけではなく、さまざまな時間領域において生じている運動性の情報を理解することが必要となる。しかしながら、従来の溶液NMR法においては、分子量40kDaを超える高分子量蛋白質や巨大蛋白質複合体について、動的な立体構造情報を詳細に解析することは困難を極めている。本課題では、核緩和機構を最適化した立体整列安定同位体標識(Stereo-array isotope labeling; SAIL)法と高圧NMR法を駆使して、高分子量蛋白質、巨大蛋白質ー蛋白質複合体の構造動態を解析する新たな手法を開発することを目指す。
平成28年度は、静水圧下において、核緩和最適化SAILアミノ酸標識したMSG及びGroELES複合体を対象にNMR測定を行い、シグナル帰属を進めた。その後、圧力・温度変化に伴うシグナル変化の解析を進めてきた。その過程において、一部の芳香環CHシグナルやメチル基CH3シグナルにおいては、シグナルの広幅化が起こり、シグナル感度が著しく低下することが分かった。このような状態では、後の定量的動態解析に支障をきたすこととなるため、新たな核緩和最適化SAILアミノ酸を設計した。この新規核緩和最適化SAILアミノ酸をMSGに導入したところ、高感度なNMRシグナルを観測することに成功した。また、蛋白質中のalanine残基のメチルシグナルを高感度に観測するために、新たなアミノ酸要求性大腸菌を利用した試料調製法について確立することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度においては、静水圧状態のMSGやGroELES複合体についてPhe, Tyr, Trp残基等の芳香環シグナル、ならびにIle, Leu, Val, Met, Alaのメチル基シグナルの帰属を進めることができた。さらに、低温・高圧状態におけるNMR測定も進めることができた。その過程において、一部のシグナルに関しては、核緩和最適化SAILアミノ酸をもってしても、NMRシグナルを高感度に観測することができない状況に遭遇したが、シグナルの低感度化の理由を分析し、安定同位体標識パターンを再検討することで、問題を解決することができた。
また、Ala残基の安定同位体標識に関して、新たな試料調製法を確立することに成功した。この技術は、本課題の発展性をさらに高めることができる技術として期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度以降は、新たに開発した核緩和最適化SAILアミノ酸を利用しつつ、MSGやGroELES複合体について、単体およびリガンド結合時におけるNMRスペクトルの解析を進め、各条件下における交換運動速度の定量解析を進める。また、圧力変化に伴うNMRスペクトルの解析も行い、交換過程における活性化体積の定量解析も行う。これらの結果から、蛋白質動態と生体機能との相関関係を明らかにすることを目指す。
尚、申請者は平成29年度より、大阪大学蛋白質研究所に異動した。NMR解析については、名古屋大学、大阪大学の装置を有効活用して、課題を進めていく。
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| Causes of Carryover |
新たなアミノ酸要求性大腸菌を利用した試料調製法ならびに重水の再蒸留法を確立することができたため、当初の予定より安定同位体試薬の購入使用額を低く抑えることができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当該使用額は、本年度におけるNMR測定用試料の調製に利用する。様々な安定同位体標識パターンを有する試料を用いたNMR測定を行うことで、より詳細な構造動態解析を進める。
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Research Products
(8 results)
