2016 Fiscal Year Research-status Report
X線構造に基づくクロストリジウム属特異的溶菌酵素の細胞壁認識分解機構の解明
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15K06973
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
神鳥 成弘 香川大学, 総合生命科学研究センター, 教授 (00262246)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 裕美 香川大学, 総合生命科学研究センター, 准教授 (10313305)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | X線結晶解析 / ウェルシュ菌 / 溶菌酵素 / ペプチドグリカン / グルコサミニダーゼ / SH3ドメイン / 細菌細胞壁 / ソーテース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌は，網目構造のペプチドグリカンからなる強固な細胞壁により細胞の形態を保持している。溶菌酵素は，細胞壁を分解し細菌を死滅させたり，部分的に分解することにより細胞分裂を助けたりする。病原性クロストリジウム属細菌に働く溶菌酵素は，ペプチドグリカン分解ドメイン（触媒ドメイン）と細胞壁結合ドメインを持ち，その溶菌活性は極めて種特異的である。本研究の目的は，クロストリジウム属特異的溶菌酵素についてX線結晶解析を行い，3次元構造情報から種特異的な細胞壁認識分解機構を分子レベルで解明することである。食中毒やガス壊疽の原因となるクロストリジウム属のウェルシュ菌が持つオートライシン（Clostridium perfringens Autolysin, Acp）は，N末側にSH3 構造モチーフのサブドメインが10個タンデムにつながっている細胞壁結合ドメインと，C末側にGH73（グルコサミニダーゼ）に属する触媒ドメインを持つ溶菌酵素である。平成28年度は，Acpの触媒ドメイン（AcpCD）の高分解能（1.76 A分解能）X線結晶解析に成功した。AcpCDは，三日月型の構造で，その中心に深い溝を基質結合部位として持つ。この溝の形と幅がグルコサミニダーゼ活性と深く関わっていることがわかった。基質が結合した構造のモデリングから活性残基を予想することができ，それらのアミノ酸変異を行い，AcpCDの基質認識・活性触媒機構について新たな知見を得た。これらの成果は学術誌に報告した（FEBS Lett. (2017) 591, 231-239）。また，細胞壁構造を認識する酵素として，ウェルシュ菌ソーテースB（CpSrtB）の1.90 A分解能のX線結晶解析に成功した。CpSrtBは，細胞表面タンパク質を基質とし，これを細胞壁に結合させる酵素であり，構造解析の結果から基質を認識する部位を予想することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
AcpCDの3次元構造をX線結晶解析により決定し，クロストリジウム属細菌に働く溶菌酵素の細胞壁認識・分解活性触媒機構について新たな知見を得て，その成果を学術誌に報告することができた（FEBS Lett. (2017) 591, 231-239）。さらに，Acpの細胞壁結合ドメインの3次元構造を決定するため，10個ある細胞壁結合サブドメインのうち，AcpCDに１つ加えたもの（AcpCWBD10），2つ加えたもの（AcpCWBD9），3つ加えたもの（AcpCWBD8），4つ加えたもの（AcpCWBD7）の計4種類のタンパク質について発現・精製・結晶化を行っており，AcpCWBD10について微結晶を得ている。ウェルシュ菌細胞壁の分解・構成機構について研究を推進するため，細胞壁構造を認識する酵素としてウェルシュ菌ソーテースBのX線結晶解析に成功し，学会発表を行うことができた（第89回日本生化学会大会，仙台）。また，他の細胞壁構造を認識する酵素として，ウェルシュ菌ソーテースCについて発現・精製・結晶化に着手している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ウェルシュ菌オートライシン（Acp）については，現在，微結晶が得られているAcpCWBD10（１つの細胞壁結合サブドメインをAcpCDに加えたもの）について，結晶化条件の最適化を行い，X線結晶解析により細胞壁結合サブドメインの構造および細胞壁結合サブドメインと触媒ドメインとの空間的位置関係を明らかにしたい。順次，細胞壁結合サブドメインを増やしたタンパク質について結晶化およびX線結晶解析を試み，全長Acpに近い3次元構造を得て，Acpの細胞壁結合機構を明らかにしていきたい。また，4つの細胞壁結合サブドメインを持つディフィシル菌（Clostridium difficile）オートライシン（Acd）については，その全長タンパク質の発現・精製に成功しており，結晶化およびX線結晶解析を試みる。ウェルシュ菌ソーテースB（CpSrtB）については，基質となるタンパク質を同定し，CpSrt・基質複合体のX線結晶解析を行い，CpSrtBがどのようにして細胞壁にタンパク質（基質）を結合させるのかを明らかにしていきたい。また，他のソーテースおよびそれらの基質についても研究を展開していく。平成29年度は，結晶化を試みるタンパク質試料が多く，新たに結晶化用インキュベーターを導入して，効率よく結晶化スクリーニングを行っていきたい。
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