2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K06976
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
沖野 望 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (90363324)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 糖脂質 / 糖転移酵素 / セラミド / ジアシルグリセロール / スフィンゴモナス / 緑膿菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スフィンゴ糖脂質は真核生物に普遍的に存在し、細胞内外の情報伝達など様々な現象に関わっている。一方、細菌の中にもスフィンゴ糖脂質を有する一群の細菌がいるが、その生理機能に関してはよく分かっていない。本研究では、我々が最近の研究で見出した細菌由来の二つの新奇糖転移酵素（スフィンゴモナス科細菌と緑膿菌）の機能解析を通して、細菌が有する糖脂質の生理機能を明らかにすることを目的としている。
平成27年度は主として、新奇糖転移酵素の発現系の構築と酵素学的性質を明らかにすることを計画していた。
スフィンゴモナス科細菌が有する新奇糖転移酵素に関しては、大腸菌で発現させた酵素を使用して、基質特異性や金属イオンに対する依存性などの諸性質を検討した。また、本酵素の生理機能を明らかにするために、予定を前倒しして、新奇糖転移酵素のノックアウトベクターを作成し、ノックアウト株の作成を進めている。また、本糖転移酵素の細胞内での局在を明らかにするために、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質と融合させた発現コンストラクトを作成した。
一方、緑膿菌の新奇糖転移酵素に関しては、糖転移酵素としての酵素活性が検出できていなかったことから、酵素活性の検出を試みた。緑膿菌はスフィンゴ脂質を持たないことから、糖の受容体としてジアシルグリセロールを用いていることが推測された。そこで、蛍光標識したジアシルグリセロールを調製し、幾つかの糖供与体を使用して、酵素活性の測定を試みた。その結果、本酵素の糖転移酵素としての酵素活性を検出することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
スフィンゴモナス科細菌が有する糖転移酵素に関しては、大腸菌で発現・精製させた酵素を使用して、酵素学的性質を調べた。また、予定を前倒しして、本糖転移酵素の生理機能を明らかにするためにノックアウトベクターを作成し、ノックアウト株の作成を進めている。また、本糖転移酵素の細胞内での局在を明らかにするために、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質（GFP）と融合させた発現コンストラクトを作成した。
緑膿菌由来の糖転移酵素に関しては、糖の受容体として考えられるジアシルグリセロールの蛍光標識体を調製した。蛍光標識ジアシルグリセロールと幾つかの糖供与体を使用して、糖転移酵素活性の測定を試みた結果、本酵素の糖転移酵素としての活性を検出することに成功した。
以上のことから、本研究は「おおむね順調に進展している」と判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
スフィンゴモナス科細菌が有する糖転移酵素に関しては、我々がこれまでに開発してきたスフィンゴ糖脂質合成酵素の高感度検出技術を改変することで、HPLCを使用した高感度定量法を開発する。また、大腸菌で調製した酵素を使用して新奇糖脂質の酵素合成法を開発する。本方法を応用して蛍光標識した糖脂質の合成が出来れば、本糖脂質の分解酵素の探索や複合糖脂質の合成酵素を探索する際の有用な基質となる。一方、緑膿菌の糖転移酵素に関しては、昨年度の研究により、糖転移酵素としての酵素活性を検出することに成功したので、本年度は基質特異性の詳細を明らかにすることを計画している。
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[Presentation] Crystal structures of unique glycosphingolipid-degrading enzymes2015
Author(s)
Nozomu Okino, Yoshimitsu Kakuta, Yoko Kato-Unoki, Reo Otsubo, Yohei Ishibashi, Utaro Kobayashi, Makoto Kimura, and Makoto Ito
Organizer
7th ACGG Annual Conference
Place of Presentation
Hotel Taikanso, Matsushima, Miyagi, Japan
Year and Date
2015-11-12 – 2015-11-15
Int'l Joint Research
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