2015 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質のC-マンノシル化糖修飾が関わる上皮細胞接着制御機構の解明
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15K06981
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
井原 義人 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70263241)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井内 陽子 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (20316087)
池崎 みどり 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (40549747)
南方 志帆 和歌山県立医科大学, 医学部, 特別研究員 (90508574)
眞鍋 史乃 国立研究開発法人理化学研究所, 主任研究員研究室等, 専任研究員 (60300901)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 糖タンパク質 / C-マンノシル化 / 細胞接着分子 / E-カドヘリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
C-マンノシル(C-Man)化は、タンパク質のトリプトファンに特異的な翻訳後の糖修飾である。C-Man化は、細胞外マトリックスに存在するThrombospondin Type I repeat (TSR)スーパーファミリーやサイトカインファミリーなどのタンパク質に多く見られる糖修飾であるが、その生体における生理的役割はいまだ不明な点が多い。本研究では、我々が発見した、C-Man化ペプチドによる上皮系細胞の細胞間接着やアドヘレンス・ジャンクション構造形成の抑制と、E-カドヘリン分子の発現レベル抑制の知見をもとに、C-Man化ペプチドの新たな生理作用の分子機構に関する解析を進める。これまでの研究で、肺上皮由来A549細胞の系において、C-Man化ペプチドによるE-カドヘリン発現の抑制が観察され、その分子機構としてE-カドヘリン発現制御に重要なSmadシグナル経路やE-カドヘリン遺伝子リプレッサーSnailを介した転写レベルでの制御が主ではないことが明らかとなった。そこで、E-カドヘリン発現の制御機構としてC-Man化ペプチドによる細胞内分解系や分子のターンオーバーへの影響の可能性を考え、これらの観点から細胞生物学的アプローチの解析を進める予定である。さらに、細胞におけるC-Man化ペプチドの結合標的タンパク質の解析と同定を進めることでその分子機構を明らかにする。また、本研究は上皮細胞接着異常が関わるがん細胞の転移・浸潤などの病態に関するC-Man化糖修飾の生理的役割の解析へと発展させることで、C-Man化糖タンパク質あるいは生理活性糖ペプチドとしてのC-Man化ペプチドがもつ新たな上皮細胞接着制御機構の解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度は、(1)ヒトThrombospondin-1のTSR2に由来するC-Man化TSRペプチドに加え、TSR配列に含まれるTrp-X-X-Trpモチーフ周辺のアミノ酸変異型を合成した。また、ビオチン化標識したC-Man化ペプチドを合成し、標的結合分子の探索に利用した。抗C-Man-Trp抗体については、さらに特異性や反応性の高い抗体の作製のため、新たな抗原エピトープの設計と合成をスタートした。一部のC-Man-Trpを多量体化したナノアフィニティー粒子などの合成は若干遅れている。(2) C-Man化ペプチドの、上皮系細胞間接着への影響を解析するため、A549細胞を用いて、C-Man化ペプチド(C-Man-Trp-Ser-Pro-Trpなど)が、アドヘレンス・ジャンクション構造の形成に与える影響について検討した。その結果、C-Man化ペプチドにより細胞間接着が阻害と、E-カドヘリンの発現レベルの減少が観察された。一方、E-カドヘリン遺伝子リプレッサーであるSnail の発現に大きな変化は無く、その上流にあるSmadシグナルの活性化は見られず、むしろ抑制されていた。さらに本事象の分子機構を明らかにするため、(3)C-Man化ペプチド結合標的分子の探索と同定を進めた。ビオチン化したC-Man化ペプチドをプローブとし、アガロースビーズ/カラムなどを用いる手法によるタンパク質精製を試み、分子量の3つの候補タンパク質を見出している。今後、この標的タンパク質のマスフィンガープリンティングによる同定や詳細な解析を進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までの進捗状況に応じて、C-Man化ペプチド結合標的分子に関する細胞接着制御の分子機構の解析を進める。さらに平成28年度は、(4)C-Man転移酵素の候補遺伝子であるマウスDPY-19L1-4遺伝子を高発現あるいは低発現するA549細胞の作製を行い、C-Man転移活性の検証と細胞間接着への影響について解析する。現時点で、マウス脾臓由来のcDNAライブラリーをもとに、RT-PCRによりDPY-19L1/L2遺伝子のcDNAクローニングを既に行っており、発現ベクターの構築については、上記のTSRドメイン発現系のベクター作製と同様の段取りで進めていく。なお、RNAiによる発現抑制については、マウス/ヒトDPY-19L1-4に対するshRNA発現ベクターを入手する。種々の発現ベクターをA549、HEK293細胞などで発現させ、DPY-19L1-4を恒常的に高発現あるいは低発現する細胞株の樹立を行う。各々の遺伝子発現細胞について、C-Man転移酵素活性についての生化学的検討と細胞接着機能の評価を上記同様の細胞生物学的手法を通じて行う。さらに、生体レベルでの機能評価解析のため、(5) C-Man化ペプチドの生体機能について、マウス細胞転移・浸潤モデルを用いて解析する。組織内可視化A549-GFP細胞を作製しIn vivo細胞転移・浸潤モデルを用いて、各種C-Man化ペプチド化合物やTSRドメインの、細胞転移・浸潤に対する作用について総合的に解析を進める。これらの解析結果を統合してタンパク質C-Man化が関わる新たな上皮細胞接着制御機構の解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
平成27年度の研究計画では、C-Man化ペプチドに結合するA549細胞内の標的タンパク質の解析と同定を完了する予定であった。標的タンパク質については、生化学的な部分精製とマスフィンガープリンティング解析により、複数の候補タンパク質に関するデータの取得が行われた。しかし、候補タンパク質の同定と確定には、特異抗体等を用いた生化学的手法による確認が必要となる。この特異抗体を用いた生化学的解析について、使用する抗体など試薬の入手や準備が年度内に間に合わなかったため、本実験の実施を次年度に持ち越すこととした。このため、生化学・免疫学的解析の関連経費を中心に繰越が生じ次年度使用額が生じることとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本研究では、マスフィンガープリンティング解析により得られた複数のC-Man化ペプチド結合標的分子の候補タンパク質の情報をもとに、それぞれの特異抗体の入手などを行う予定であり、研究費の繰越分は、目的タンパク質の確認と同定のための生化学・免疫学的解析に関連する研究試薬や材料の入手に使用する。
さらに、C-Man化ペプチドによる細胞接着の抑制状況おける、標的分子の細胞内動態に関する形態学的解析や、アドへレンスジャンクション形成関連分子と標的分子との関連についての生化学的解析に対しても、必要な研究試薬や材料入手のための研究費を充当する。
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