2016 Fiscal Year Research-status Report
ナノディスクに組み込んだカルシウムポンプを用いた脂質タンパク相互作用の解析
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15K06988
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 講師 (60241428)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | カルシウムポンプ / イオン輸送 / ナノディスク / 静電的相互作用 / リン脂質 / 膜タンパク質 / 表面電荷 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに筋小胞体カルシウムポンプ（SR Ca2+-ATPase)をナノディスク（Nanodiscs)に組み込む条件を検索し、Ca2+-ATPase活性を保ったまま、ナノディスクに組み込むことが可能であること、組み込んだ標品はゲルろ過により生成が可能であること、ナノディスク中の脂質ヘッドグループ（PC, PS,PG)の違いにより活性が影響を受けること、ヘッドグループの持つ影響を立体的影響と静電的影響に切り分けることが可能であることなどを示した。
今年度はさらにフォスファチジルセリン（PS）を含むナノディスクも作成しさらに詳細な解析を進めた。また、解析方法として、Native PAGEを導入することにより、作成したナノディスクの表面電荷を定量的に扱うことが可能となった。また詳細な解析を行う際、筋小胞体膜から持ち込まれる因子（脂質等）が問題となってきたため、Ca2+-ATPaseを部分精製してナノディスクに組み込んだ標品を用いるように変えた。ナノディスク中の脂質組成を色々と変化させ膜の表面電荷の変化を見たところ、PG/PC、PS/PCの混合系で膜の表面電荷が脂質の混合比に応じて変わっていくことが示された。さらにCa2+-ATPaseのEP転換過程速度をイオン強度を変えて測定することにより、この反応過程における静電的相互作用の寄与を見積もり、先に見積もった表面電荷との関係を見たところ、PG/PCの混合系で非常に良い直線関係が示された。この結果は、膜の表面電荷がCa2+-ATPaseの反応素過程の速度に直接影響を及ぼしていることを示唆している。また表面電荷と静電相互作用の関係から、脂質によっては表面電荷だけではなく、Ca2+-ATPaseと特異的な静電相互作用を持つことも示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初今年度予定していた、POPSを用いたナノディスクへのカルシウムポンプの組み込みを行い、混合脂質のナノディスクを用い脂質の電荷とEP転換ステップにおける静電相互作用の寄与とに関係についての定量的な解析を達成することができた。その結果脂質ヘッドグループの電荷とCa2+-ATPaseとの直接的静電相互作用による活性への影響を明らかにするだけではなく、膜全体の表面電荷がCa2+-ATPaseの反応に影響を及ばす可能性を示すデータが得られつつある。膜の表面電荷の効果は予期していなかった結果であり、この効果を直接的に証明する結果が得られるならば、Ca2+-ATPaseのみならず他の膜タンパクや、膜を介する代謝反応にも適用できる概念である。この知見は新しいだけでなく、この考えを適用することにより今までにない角度から生体膜系の理解が深まる可能性を有している。従って当初の計画以上に興味深いデータが出ているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の展開としては、まず膜の表面電荷が直接的にCa2+-ATPaseの反応に対して影響を及ぼしているのかについて確定させるデータを集めていく。そのためには膜脂質の量比を変え表面電荷を変化させ活性への影響を評価すると同時に、別な方法で表面電荷を変えてその影響を見ることも試みてゆく。またアルキル鎖を変えて膜厚が変化したときの影響についても見てみる。次にCa2+-ATPaseに特異的に結合して影響を及ぼすと見られる脂質についてさらに解析を進めていきたい。そのためには、Ca2+-ATPaseの変異体をナノディスクに組み込んだ標品を作り、その性質について解析していくことも考えている。この場合変異体の大量発現と精製が不可欠であり、そのための系の確立が課題になると考えられるが、現在持っている発現系及び精製方法のスケールアップで対応できると考えている。
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| Causes of Carryover |
変異体の発現とナノディスクへの組み込みを試みる予定であったが、筋小胞体由来のCa2+-ATPaseを用いた測定の重要度が増したため、後回しになり変異体の発現、精製及びナノディスクへの組み込み実験にまだ着手していない。そのため細胞培養、遺伝子導入試薬等の費用が浮いている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は変異体の発現精製を行うため、そのために使う予定である。
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Research Products
(7 results)
