共生菌である根粒菌における３型分泌系の機能発現機構

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K07003
• Research Institution: Nara Women's University
• Principal Investigator: 佐伯 和彦 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (40201511)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 根粒共生 / 転写因子 / 菌体外分泌装置

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、根粒菌３型分泌系の新たなエフェクター遺伝子の同定、また分泌装置の構築や分泌に関与する因子の同定を目指して、1）転写制御のcisおよびtrans因子の解析と、2）分泌活性レポーターアッセイ系の構築により分泌シグナル配列の同定を行っている。
1）TtsIに関するChIP-seq解析によるtts-boxの精密同定：ミヤコグサ根粒菌Mesorhizobium lotiのTtsIのN末端に精製タグとして(His)6配列を付加しても、ttsI欠損株内で生理活性を保つことを確認していたので、Ni-ゲルを用いてタグ付きTtsIの精製を行った。ミヤコグサ本来のNodD-TtsI誘導因子が不明なため、クロ－バー根粒菌のnodD遺伝子を導入した上でクローバーの因子であるナリンゲニンの添加により、タグ付きTtsIの誘導を試みた。当初用いたTK社製のナリンゲニンで誘導活性が得られず、別のSA社製の試薬により誘導可能なことが判明するまで試行錯誤を繰り返した。最終的には、ミヤコグサ根粒菌自体を宿主として、発現、菌体破砕物からのNiアフィニティクロマトグラフィおよびゲル濾過により、純度95%以上のTtsIを得た。ダイズ根粒菌Bradyrhizobium elkaniiのTtsIについても同様の実験系を構築した。
2）３型分泌装置活性測定系の構築：本研究では、根粒菌エフェクターNopXとMlrのN末端60アミノ酸のC末端側に、深海性エビOplophorus gracilirostris由来のルシフェラーゼNlucを付加する融合遺伝子を構築し、該当エフェクター自身のプロモーターに下流に配置するように根粒菌のゲノム内に組み込んだ菌株を作製した。次に、上述と同様に誘導を試みたが、実際の誘導まで試行錯誤を繰り返すことになった。現在までに、Nluc付加物が細胞内で活性型となっていることまでの確認を終えた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

概要に記載の通り、ttsI遺伝子をin vitroで誘導する段階で予期せぬ停滞があったため、計画に比べてやや進捗が遅れている。既知の根粒菌の3型分泌系は、共生因子合成系遺伝子の共通転写因子で有るNodDに植物側の分泌因子で有るフラボノイドが結合して活性型となり、3型分泌系遺伝子の転写因子で有るttsI遺伝子上流に結合して、TtsIタンパク質の発現を誘導することが知られている。本研究では、クローバー根粒菌のnodD遺伝子をミヤコグサ根粒菌に導入した上で、クローバー由来の分泌因子であるナリンゲニンを試薬として購入して用いた。しかしながら、誘導物質として用いたナリンゲニンが試薬メーカーおよび製造ロットの違いにより、著しく低い活性しか示さないものがあることにより、その解決までかなりの時間を費やし、転写因子関連ならびに分泌活性関連のいずれも足踏み状態が続いた。現在は、試薬メーカーを替えることにより、同問題は解決するとともに、ミヤコグサ由来フラボノイドを同定するための検出条件を検討中である。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度に引き続き、根粒菌３型分泌系に関し、1）転写制御のcisおよびtrans因子の解析と、2）分泌活性レポーターアッセイ系の構築により分泌シグナル配列の同定を行う。停滞が有った分、より効率的・効果的な実験進行に務める。
1）TtsIに関するChIP-seq解析によるtts-boxの精密同定：Ni-ゲルを用いたDNA-TtsI架橋体の捕集が可能であるかを確認し、可能であれば抗体でなくNi-ゲル沈降によるChIP-seq解析を実施する。不可能であれば、Myc-tagの付加により抗Myc抗体を用いるか、精製したタグ付TtsIを抗原としてポリクローナル抗体を調整し、通常のChIP-seq解析に進む。ChIP-seq解析で得られたデータを、根粒菌ゲノムへのマッピングし、TtsI結合のコンセンサス配列を同定する。さらに、TtsI結合コンセンサス配列下流に３型分泌遺伝子候補を検出、破壊株の作製と共生形質評価を行う。
2）３型分泌装置活性測定系の構築：根粒菌エフェクター遺伝子としてnopCなどの複数のものを用い、且つ、N末端側の長さを変えて、Nlucとの融合遺伝子を構築する。また、C末端に (His)6配列を付加し、Niゲルによる回収濃縮とNlucによる高感度検出を狙う。キメラ遺伝子をエフェクター自身のプロモーターに下流に配置するように根粒菌内に組み込んだ菌株を培養し、宿主由来フラボノイドを用いて３型分泌系を誘導、培養上清からNiゲルを用いて濃縮後、発光活性を測定することで、分泌活性の測定系を構築する。

Causes of Carryover

実施状況で説明したように、試薬として当初に購入した活性化因子に誘導活性が認められなかったため、その問題解決まで実験実施が停滞した。剰余金額は停滞により実施できなかったChIP実験分である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

誘導因子の問題が解決したので、遅延していた実験を含めて平成28年度に実施するため、全体としての計画は不変である。ただし、年間に実施する実験量が当初よりも増えるため、より効率的・効果的な実験進行に務める。