2018 Fiscal Year Annual Research Report
On the Mechanism of Functional Expression of Rhizobial Type III Secretion System
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15K07003
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| Research Institution | Nara Women's University |
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Principal Investigator |
佐伯 和彦 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (40201511)
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2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 根粒共生 / 転写因子 / 菌体外分泌装 / 広域宿主ベクター / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、根粒菌３型分泌系の新たなエフェクター遺伝子候補の探索ならびに分泌関連因子の同定と利用を目指して、1）転写制御のcisおよびtrans因子の解析、ならびに、2）分泌活性レポーターアッセイ系の構築により分泌シグナル配列の同定、を行った。また、エフェクター候補遺伝子の破壊実験を効率的に進めるために、3）Streptococcus pyogenes由来のCRISPR/Cas9に基づくゲノム編集技術を根粒菌と近縁のαプロテオバクテリアに適用するための新規なベクター・セットの開発を行った。
1）ゲノム上のttsI遺伝子を破壊しhexaHis-TtsIを発現するプラスミドを導入したミヤコグサ根粒菌株を試料として、ChIP-seq実験を行った。平成30年度に実施した再実験においても、既知の3型分泌系遺伝子上流領域以外の配列が検出されず、新規なエフェクター遺伝子の候補は得られていない。
2）深海性エビOplophorus gracilirostris由来のルシフェラーゼNlucをC末端側に付加したNopXおよびMlr6358融合遺伝子を構築し、該当３型分泌タンパク質遺伝子自身のプロモーターに下流に配置するように根粒菌のゲノム内に組み込んだ菌株を用いて、発現誘導を行い上清のルシフェラーゼ活性を定量した。３型分泌系の分泌活性測定の一般手段としての開発を目指していたが、菌体内に留まる活性が大量で溶菌物由来の活性との区別に容易ではなく、一般手段とするに至らなかった。
３)CRISPR/Cas9系を根粒菌やその他のαプロテオバクテリアに適用するために、任意の20塩基対のDNA配列に4塩基ずつの接着末端を付加してcrRNAとしてCas9とtracrRNAとともに安定かつ効率よく発現させるベクターを、CRISPR/Cas9発現後に分断・除去可能なRK2由来プラスミドとして開発した。
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