2016 Fiscal Year Research-status Report
Mrp型Na+/H+アンチポーターのイオン選択透過機構とイオン輸送経路の解明
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15K07012
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
伊藤 政博 東洋大学, 生命科学部, 教授 (80297738)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アンチポーター / Mrp / イオン選択性 / カルシウムイオン / 好アルカリ性細菌 / Bacillus / pHホメオスタシス / ナトリウムイオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では多くの微生物が普遍的に持ち、感染症や多剤耐性菌予防のターゲットタンパク質としても注目されているMrp型Na+/H+ アンチポーターを研究対象とし、この酵素のイオン輸送経路を解明を目的とした。近年、この酵素の相同タンパク質にNa+やK+以外にもCa2+を輸送するものが報告された。そこで、輸送するイオンの異なる3種類のMrpホモログを利用して、本研究の目的の解明を試みた。平成28年度は平成27年度に引き続き、3種類のMrp間の同一サブユニットを他のMrp由来のものと交換し、イオン選択性の変化を調べた。実験に用いたMrpアンチポーターは、Bacillus pseudofirmus由来のNa+/H+型、Bacillus alcalophilus由来のK+/H+型、Thermomicrobium roseum由来のCa2+/H+型である。2つの遺伝子断片をPCRで連結し、サブユニットを交換したmrp遺伝子を構築し、この遺伝子を保持するプラスミドを大腸菌のNa+感受性株に形質転換し、変異型Mrpを発現させた。実験は、複合体I のプロトン輸送サブユニットと相同性があるMrpAとMrpDで行った。その結果、Na+/H+型にCa2+/H+型のMrpAとMrpDを導入したものでは、Ca2+のみを輸送することを明らかにした。これは、MrpAとMrpDサブユニットが共役イオンの輸送や共役イオン特異性に関与していることを示唆していた。Na+/H+型にK+/H+型のMrpAとMrpDを導入したものは、うまく複合体を形成できないため、酵素活性がないことが分かった。現在、Na+/H+型にCa2+/H+型のMrpAとMrpDを導入したものに部位特異的変異の導入およびMrpAとMrpDの膜貫通領域の一部分を交換した変異を導入して、どの領域が共役イオン選択性に重要であるかの絞り込みを行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の研究実績の概要に記したテーマに関しては、おおむね順調に進展していると考えている。新しい変異株の構築も順次、進めており、今後更に研究の進展が期待できる。Ca2+/H+型Mrpの一部とNa+/H+型Mrpの残りのサブユニットを組み合わせたヘテロMrp複合体ではCa2+/H+型アンチポート活性が測定されていることから、この成果とオン輸送に関わるサブユニットや変異箇所の情報を利用し、変異箇所近傍におけるMrp型アンチポーターの相同性解析を行うことで研究目的の解明につながると期待している。平成29年度はこれまでの成果を踏まえて大きな結論に導き出せればと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、平成28年度までに得られた結果をもとにMrpサブユニットのどこの領域がイオン選択透過機構に重要なのかを解明することに集中する。候補領域については、まずNa+/H+型の候補領域（10~20アミノ酸残基長）をそのまま、Ca２+/H+型アンチポーター内の相同領域と置き換えたキメラ型Mrpを大腸菌発現ベクターにクローニングする。KNabc株にキメラ型Mrpをコードした遺伝子を保持するプラスミドを形質転換し、キメラ型Mrpを発現させる。もしも、キメラ型Mrpが基質特異性を変化させ、Na+/H+アンチポート活性を持つような変異型が出現した場合、大腸菌形質転換株が200ｍM-NaClを添加した寒天培地上でも生育することが期待される。この寒天培地上に生育した候補株についての実験は、既に説明した方法で進める。これにより、最終的にイオン選択透過に重要な領域を同定する。
また、これまで蓄積されたNa+型Mrpの変異導入実験の結果と今回の結果、それと複合体Iのプロトン輸送経路情報を利用してMrp型アンチポーターのプロトン側の輸送経路について解析も試みる。これに関しては、Na+(Ca2+)輸送に関与するサブユニットや領域を同定できれば、プロトン輸送領域を絞り込むことができると推定される。そして、複合体I のプロトン輸送サブユニットと相同性があるMrpAとMrpDのどちらか、又は両サブユニットがプロトンを輸送していると推定し、追加の変異導入実験を計画し、解明を進めたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
平成28年度は、当初の予定では人工遺伝子合成を用いて変異株の構築を予定していたが、他の実験計画の状況からこの実験の一部を平成29年度以降に行うこととした。その結果、その分の人工遺伝子合成の費用を執行しなかったため次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度に行わなかった一部の人工遺伝子合成にかかる費用を平成29年度に行う予定である。この実験に必要な試薬や消耗品の購入も執行する予定である。
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Research Products
(6 results)
