2017 Fiscal Year Research-status Report
ATP合成酵素のATPモーターとプロトンモーターをつなぐ分子内クラッチ
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15K07013
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
山田 康之 立教大学, 理学部, 教授 (80386507)
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2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 脱共役 / 酸化的リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、不活性変異体を用いた共役の解析、Biacoreでのサブユニット間相互作用解析に向けたサンプル調製条件の検討などを行った。
不活性変異体を用いた共役の解析では、脱共役する条件を詳細に検討することを目的とし、好熱菌（Bacillus PS3）ATP合成酵素（TFoF1）のFo-cサブユニットにプロトンが結合しない変異体を作製し、解析を行った。この変異体は、共役条件下では低いNTPase活性を持ち、脱共役条件下では高いNTPase活性を持つことが期待される。作製した変異体について、共役条件下であるATPase活性を測定したところ、予想に反し高い活性を示した。また、この変異体にさらにεサブユニットへの変異を加え、ヌクレオチド条件によらず共役すると考えられる変異体も作製したところ、二重変異体においても高いATPase活性が見られた。これらの結果から、通常使用しているサンプルには、εサブユニットへのヌクレオチド結合に依存した条件的脱共役ではない形で脱共役したものが含まれていることが示唆された。現在、共役の良いTFoF1が得られるサンプル調製の条件を検討している。
Biacoreでのサブユニット間相互作用解析に向けたサンプル調製では、これまでにcサブユニット単体、Foでの発現系を検討してきたが、いずれからもcサブユニットリングを調製することができなかった。そこで本年度は、FoF1全体での発現系からcサブユニットリングを調製することを試みた。しかし、適当な精製条件を見出すには至っていない。
この他、ATP結合能の高い変異体εサブユニットについて、その構造・構造変化のモデルを検討した。脱共役時のεサブユニットC末端ドメインの働きについての重要な情報になるものと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Biacoreでの解析に必要なサンプルの調製が遅れている。
また、使用しているサンプルに、εサブユニットのヌクレオチド結合状態に依存しない脱共役が見られたため、これを改善する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、Biacore測定のためのサンプル調製の条件検討、共役の良いサンプルを調製するための条件検討を進める。
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| Causes of Carryover |
Biacore測定用サンプルの調製ができておらず、その測定に関する経費が未使用となっているため。
今年度は、サンプル調製の条件を検討し、測定に使用する。また、共役の良いサンプルを得るための条件を検討するために、界面活性剤などを購入する。これらに助成金を用いる。
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