2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K07014
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 俊治 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 主幹研究員 (60618809)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | F1-ATPase / FoF1-ATP合成酵素 / 生体エネルギー変換 / 分子モーター / 結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度では、ヒトF1と99%(触媒サブユニット)のアミノ酸配列相同性を持つウシF1を用いる事により、研究が大きく進展したが、第二年度でもウシF1を用いる事により大きな進展が見られた。初年度では、まず顕微鏡一分子解析により、阻害剤(レスベラトロールなど)によりウシF1の機能がどのように阻害されるかを、顕微鏡を用いた一分子回転観察により分析し、その阻害様式の決定に成功した。さらにウシF1の結晶構造解析システムを立ち上げ、阻害剤との複合体の結晶構造を決定することにより、阻害剤がウシF1に与える影響を、立体構造的にディスカッションが出来るようになった。しかし、立ち上がった結晶構造解析システムには今だ改善の余地があり、更なる分解能の向上や、応用的な分析法を確立する必要があった。そこで第二年度では、ウシF1の回転制御機構を詳細に明らかにしその制御機構を議論する為に、ウシF1のX線結晶構造解析の更なる発展を試みた。まず結晶化・凍結の条件検討を行い、より分解能が高い構造を得る事に成功した。さらに、ウシF1の結晶が、結晶成長後に外部からチオリン酸を導入(もしくは除去)する事により、回転軸を回転させる事が可能であるが判明した。驚くべき事に、ウシF1の結晶はこの操作により崩壊しない。そこでリン酸(実験ではチオリン酸)の結合・解離による約25度の回転を結晶中で発生させ、さまざまな回転中間体構造の同定、さらにはリン酸が解離していく様子のスナップショットを時分割結晶構造で明らかにする分析システムの確立に成功した。その結果、リン酸結合・解離による回転力発生の仕組みを原子レベルの構造変化の連続的な流れで明らかにする事に成功し、回転とその制御機構を理解するための理論的基盤が入手された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
第二度の研究のうち、進展著しい結晶構造解析に関してを中心に述べます。初年度に行った通常のX線結晶構造解析の手法により、生成物リン酸(実験ではチオリン酸)の解離前後の構造と、その中間体構造が得られた。しかし結晶化条件よっては、リン酸結合部位に硫酸イオンが結合しているなどの問題があった。そこで様々な塩を検討し、硫酸フリーの条件で結晶を得る事に成功した。さらに様々な条件検討の結果、溶液中のチオリン酸の有無のみの違いによりリン酸解離前と後の構造を得る事に成功し、立体構造の微小な違いを、リン酸の有無のみの違いに起因するものとして議論出来ようになった。そしてこれら新旧の結晶化条件から得られた結晶の分析条件(凍結条件など)をさらに突き詰める事により、全体的に分解能を向上させることに成功し、最大1.84～2.0Aの構造も複数得る事にも成功した。
また同時に、ウシF1の結晶は結晶を崩壊させる事なく、結晶中の回転子を回転させる事が出来るという興味深い特性がある事を見出した。そこで、得られた結晶にチオリン酸を様々な濃度でソーキングした結果、回転中間体を複数入手する事に成功した。また、チオリン酸が結合している結晶をスタート材料に、チオリン酸除去後の時間を変えて分析する事により、時間が経過するにつれチオリン酸が外れながらF1の回転子が回転して行く様子が中間体の結晶構造により明らかになった(全て前構造決定)。これらの時分割結晶構造解析から得られた中間体構造は、先に行った通常の結晶構造解析法により得られた回転中間体と、類似のものが複数得られた。この結果は、この時分割法により得られた中間体構造が正しく回転中間体を観測している事を示唆している。この結果により、初年度に得られたレスベラトロールなどの阻害剤の結合部位が、回転に伴いどのように変化していくかが明らかになり、詳細な議論が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
第二年度に結晶構造解析から得られた結果は、F1の機能調節機構を解明する上で非常に有用な理論的基盤となる。さらに同時に、分子モーターがATP加水分解やリガンドの解離により、どのようにして力を発生させているか、その観点で非常に有用な知見が得られる事が期待される。このように分子モーターが力を発生している瞬間を、これほど細かいスナップショットで分析できるシステムは類を見ない。今後、今回確立した結晶構造解析システムを最大限発展させつつ、哺乳類F1の回転とその調節機構の解明を進めていく。
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| Causes of Carryover |
次年度計画している結晶構造解析に必要な、結晶輸送容器の購入に必要なため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画通り、該当する結晶構造解析を行う。結晶輸送用容器の購入を行う。
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