2015 Fiscal Year Research-status Report
脳神経系ムチン型糖鎖修飾に関わるオーファン糖転移酵素の機能解析
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15K07015
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
黒坂 光 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90186536)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 喜明 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (40512455)
加藤 啓子 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90252684)
中村 直介 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (30424964)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ムチン型糖鎖 / ゲノム編集 / 変異体 / 神経 / 糖転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の主要な翻訳後修飾反応であるムチン型糖鎖修飾が神経機能に及ぼす影響を調べた．初年度は，ムチン型糖鎖の合成反応を開始するN-アセチルガラクトサミン転移酵素(GalNAc-T)のなかで，in vitroで酵素活性が検出されず，基質が未同定のオーファン酵素に注目した．これらの酵素について，ゼブラフィッシュ，培養細胞を用いてTALEN/CRISPR法などのゲノム編集により変異体を作製し，胚の初期発生，神経系の分化や機能などとの関連について解析した．
逆遺伝学的手法による解析を用いて脊椎モデル生物であるゼブラフィッシュにおけるオーファン酵素の機能を調べた．それぞれのアイソザイムについて，人工ヌクレアーゼであるTALENあるいはCRISPR/Casを用いて変異体作製を試みた．今年度は，GalNAc-T8, および-T9, -T17を標的遺伝子として，ゼブラフィッシュオルソログ遺伝子配列をもとにして，ゲノム編集用のコンストラクトを作製した．特異的な変異導入を確認するため，各遺伝子について２種類以上のコンストラクトを設計し，ゼブラフィッシュへの初期胚にマイクロインジェクションした．変異の有無は，PCRを利用したheteroduplex mobility assay（HMA）法で調べ，その情報をもとに，交配を行い，これまでGalNAc－T8, -T9の変異体を作製することに成功した．
また，機能未知アイソザイム解析の別のアプローチとしてマウス胚性癌細胞P19を用いて，アイソザイムの神経分化に与える影響を解析した．P19細胞についても，CRISPR法を用いて各アイソザイムについての変異体を作製する実験を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り，概ね順調に実験は進んでいる．一部のアイソザイムについて，ゼブラフィッシュの変異体を作成することができていないが，他のアイソザイムと同様の方法で研究を進める事ができると判断している．
培養細胞を用いた実験では，変異体作製に予想よりも多くの時間を費やしているが，こちらも順調に進んでいる．
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| Strategy for Future Research Activity |
ムチン型糖鎖の生合成開始反応に関わるGalNAc-Tに加えて，神経系に強く発現するシアル酸転移酵素についても変異体作製実験を開始する．ゼブラフィッシュにおいてはGalNAc-Tで変異体を作成することに成功しているので，シアル酸転移酵素についても同じ手法を用いて効率よく，変異体を作成する．これからは変異体に関して，組織形成や維持に関わるマーカー分子の発現解析を行う．また，変異体の初期胚や組織切片のレクチン染色，また組織抽出液のレクチンブロット解析により，糖鎖構造の解析も進めて行く予定である．
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| Causes of Carryover |
オーファン酵素の変異体作製実験において，一部の酵素の変異体作製が翌年度分の実験となった．また，培養細胞を用いた変異体作製実験が予想よりも時間がかかったため．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ゼブラフィッシュ，培養細胞を用いた実験で翌年度持ち越し分については，当初の計画通りの方法で進める．翌年度持ち越した経費はこれらの実験を遂行する経費として使用する．
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