2016 Fiscal Year Research-status Report
脳神経系ムチン型糖鎖修飾に関わるオーファン糖転移酵素の機能解析
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15K07015
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
黒坂 光 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90186536)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中山 喜明 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (40512455)
加藤 啓子 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90252684)
中村 直介 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (30424964)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ムチン型糖鎖 / 糖転移酵素 / ゲノム編集 / ゼブラフィッシュ / 神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ムチン型糖鎖の生合成開始反応を触媒するポリペプチド Nーアセチルガラクトサミン転移酵素は大きな遺伝子ファミリーを構成する．その中に脊椎生物に特異的に発現し，in vitroでの酵素活性が検出されていないアイソザイムファミリーが存在する．本年度は，これらのアイソザイムについて，CRISPR/Cas9システムを用いて，ゼブラフィッシュのヘテロ変異体（一部はホモ変異体）を作製することに成功した．アイソザイムのいくつかは，脳特異的に発現することから，ゼブラフィッシュの発生における脳の表現系に焦点を置いて，解析を進めている．一部のアイソザイムでは，後脳領域の形態異常を観察することができたが，個体数が少ないためさらなる解析が必要である．また，これらのアイソザイムについては，培養細胞を用いた解析も行っている．レチノイン酸存在下で培養することで，神経細胞に分化する培養細胞株を用いて，CRISPR/Cas9法により変異体の作製のための準備を整えた．培養細胞を用いた実験においては，野生株と変異体を比較することで，それぞれのアイソザイムの基質を同定する実験を予定している．
この他に，ムチン型糖鎖の伸長反応と伸長停止反応に関わる，ガラクトース転移酵素，シアル酸転移酵素についても，培養細胞を用いた変異体作製実験に着手した．培養細胞の標的塩基配列の同定とゲノム編集のためのRNA，Cas9タンパク質をすでに入手しており，ゲノム編集，限界希釈法による細胞クローニング実験を行う予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゼブラフィシュを用いて実験では，いくつかの糖転移酵素アイソザイムについては，CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により，ヘテロあるいはホモ変異体を作成することができた．変異体の個体数が十分得られていないことに課題を残すが，今後の解析に十分期待ができる．
培養細胞を用いた実験については，塩基配列の決定，RNAの合成等，さらにシングルセルクローニングなどの準備を整えることができたものの，変異体の作製には至っていない．複数のアイソザイムに関して，ゲノム編集実験を同時並行で行なって，変異体作製を進めていく予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
ゼブラフィッシュを用いた変異体作製実験では，ヘテロ変異体の交配実験を進めて，より多くの個体のホモ変異体を作成していく予定である．ホモ変異体において，表現系に変化が見られない場合は，他の糖転移酵素などの発現亢進などにより正常な表現型を獲得した可能性を考慮し，２つ以上の分子の欠失変異体作製実験も行う．
培養細胞に関する実験では，ゲノム編集の準備段階は終えているため，リポフクションによるCRISPR/Cas9の導入実験にすぐに着手する．ムチン型糖鎖の合成に関わる標的分子のゲノム編集実験を同時並行して進める予定である．
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| Causes of Carryover |
ゼブラフィッシュのホモ変異体作製実験の一部が完了していない．また，培養細胞を用いた変異体作製実験については，実験の進行が遅れており，来年度に着手することとなった．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ゼブラフィッシュ，培養細胞を用いたゲノム編集実験に関わる物品費として，経費を使用する予定である．
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