2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K07022
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
矢島 潤一郎 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (00453499)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須河 光弘 東京大学, 総合文化研究科, 助教 (80626383)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | キネシン / ncd / 微小管 / モータータンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小管上をプラス端方向に移動するキネシン-1とマイナス端方向に移動するキネシン-14とのキメラタンパク質の運動観察により、運動方向を決定する部位の特定が試みられてきた。しかしながら、運動方向決定部位の共通認識には至らず、キネシンが微小管上で運動方向を決定する分子機構は未だ解明されていない。そこで本申請研究では、単量体型キメラキネシンを作成し、構造的な基盤に基づき、キネシンの運動方向を決定する分子機構を明らかにすることを目指す。本年度は主に、１）キネシン-1とキネシン-14のネックやネックリンカー部位を入れ替えたキメラキネシンのDNAコンストラクトを網羅的に作成し、可溶化条件などを検討し大腸菌内で発現、精製を行った。２）in vitro微小管滑り運動実験系により、作成したキメラコンストラクトの中で運動方向が逆になるようなキメラキネシンを選抜し、生化学的な測定（微小管依存的ATP加水分解速度等）を行った。３）単量体型キメラによって駆動される微小管の滑り運動速度は非常に遅く、光学顕微鏡下で長時間、精度よく位置の検出を行う必要があった。長時間の撮影では、温度変化に起因したステージなどでのドリフトにより試料のずれが生じるため、温度変化をできる限り低減させた恒温チャンバーの開発を行った。加えて、3）微小管を吊り橋上に固定し、キネシンがあらゆる側面で運動可能な実験系の構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
研究計画で掲げていた、(1)単量体型キメラの作成、(2)運動方向を逆転させるキメラタンパク質の発見、及び、(3)長時間観察のため、ドリフトを低減させた恒温チャンバーシステムの構築、(4)微小管の固定方法において、予定通りの成果が得られたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
２７年度に発見した運動方向を逆転させるキメラキネシンの微小管上での運動を３次元空間で定量する。キネシンファミリーに属するキネシン全般に共通した運動方向決定の分子機構の解明のため、キネシン-1および-14以外のキネシンにおいても、変異体コンストラクトを用いて、運動測定を行い、運動方向を決定する部位を同定する。
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| Causes of Carryover |
本申請研究は採択時期が通常よりも遅く（１０月）、予定していたタンパク質の精製が追い付かず、精製に関する消耗品の購入ができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
技術補助員を雇用し、補助員により２７年度に精製予定であったたんぱく質の精製を行う。
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