2016 Fiscal Year Research-status Report
ホモダイマー型光合成反応中心の分子構築と反応制御機構の解明
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15K07026
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大岡 宏造 大阪大学, 理学研究科, 准教授 (30201966)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 光合成 / 反応中心 / 初期電荷分離 / 電子伝達 / ヘリオバクテリア / FeSタンパク質 / ESR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．ヘリオバクテリア光合成反応中心とPshB（FA/FBタンパク）の再構成実験：PshBタンパクの候補遺伝子であるfd1およびfd2の大量発現、精製を試みた。菌体破砕後の抽出液の硫安分画、疎水クロマトグラフィーにより粗精製画分を得た。予備的実験として、これら2種類の粗精製フェレドキシンとコアタンパクとの再構成実験を行った。閃光照射による過渡吸収変化スペクトルを測定したところ、 Fd1、Fd2 を用いた各再構成系において [FA/FB]-とP800+との電荷再結合に由来する成分（t1/2 = 130 ms）が観測された。このことはFd1もコアタンパクと結合することができ、in vivoではPshBサブユニットとして機能する可能性が示唆された。
２．ヘリオバクテリア光合成反応中心の電子供与体PetJの大量発現系構築：PetJはモノヘム型シトクロムcであり、反応中心P800への電子供与体として機能することが報告されている。大腸菌でのcmc遺伝子クラスターとの共発現系を用い、大量発現系を構築した。菌体破砕後の抽出液を、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製画分を得た。しかしながらコアタンパクとの再構成実験を行ったところ、電子伝達活性を確認することができなかった。PetJの酸化還元電位が高電位側に変化したことが推測され、滴定実験等で確認する必要がある。
３．ヘリオバクテリア反応中心の結晶化・構造解析：昨年度より回折実験可能な回折強度データが得られているが（未発表）、さらなる分解能向上を目指し、諸条件の再検討、および計算による精密化を行っている。
４．時間分解EPRによるヘリオバクテリア反応中心での初期ラジカル対生成：初期電化分離の機構を明らかにする目的で、閃光照射後のP800＋A0－ラジカルペアを ESRにより観測した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
学部４年生が新たに研究室に配属されたので、当初の研究計画である緑色イオウ細菌反応中心の人工的ヘテロダイマーの収率向上および解析については、本年度は一旦中断した。今後の研究遂行において反応中心複合体の再構成実験は必須であり、そのために必要となるPscBタンパク（A/Bタンパク）をコードするpscB遺伝子のクローニングおよび大腸菌での大量発現、精製を基礎的なトレーニングとして行った。これまでPscBタンパクのホロ型に関しては、アポ型を大腸菌で発現後、in vitroでchemicalにFe-Sクラスターを再構成することで得ることができていた。今回、isc遺伝子クラスターとの共発現系を構築することでホロ型の発現を試みたところ、菌は赤みがかった色を呈し、クラスターが保持されていることが示唆された。現在、精製を進めつつあり、粗精製標品のESRスペクトルを測定したところ、[4Fe-4S]型クラスターを持つことが観察された。来年度以降の研究に繋がっていくことが期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画である人工的ヘテロダイマーの収率向上および解析を本年度は進めていく予定である。
１．ヘテロダイマーの収量向上に向けて： これまで緑色イオウ細菌の破砕にはフレンチプレスのみで行ってきたが、破砕効率は余りよくない。そこで破砕用緩衝液にリゾチームを加えることで、フレンチプレスによる破砕効率が上昇することを予備的に確認している。また可溶化におけるpHや塩濃度の条件を再検討することにより、可溶化効率の改善を試みる。
２．緑色イオウ細菌反応中心コアタンパクの調製と分光学的測定： これまで緑色イオウ細菌反応中心からコアタンパクを調製する方法は報告されていない。集光生のFMOタンパクがNa2CO3処理により外れるとの報告があり、Ni樹脂に反応中心標品を吸着させた後、Na2CO3処理を試みる。PscBタンパク（A/Bタンパク）を上手く外すことができたなら、閃光照射による過渡吸収測定や蛍光寿命測定を行う。得られた結果を、ヘリオバクテリア反応中心コアタンパクのデータと比較する。
３． 再構成実験： 上記２で調製した緑色イオウ細菌反応中心コアタンパクにPscBタンパクを再構成させ、閃光照射後の電荷分離反応や電荷再結合反応に由来する過渡吸収変化を測定する。
４．反応中心の結晶化および構造解析： 引き続き、ヘリオバクテリア反応中心の分解能向上に向けた結晶化に取り組んでいく。これに加え、緑色イオウ細菌反応中心の結晶化にも取り組んでいく。
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| Causes of Carryover |
現在までの進捗状況で述べたように、今年度は可溶化による標品調製を頻繁に行うことはなかった。そのため界面活性剤の使用頻度が低く、在庫で十分であり、新たに購入することはなかった。その他、精製に必要なNi樹脂の購入をしなかった。これらの理由により、次年度の予算使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度の研究遂行に必要とされる試薬類の購入費として使用予定である。
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[Journal Article] Light-induced hydrogen production by photosystem I-Pt nanoparticle conjugates immobilized in porous glass plate nanopores.2016
Author(s)
T. Noji, T. Suzuki, M. Kondo, T. Jin, K. Kawakami, T. Mizuno, H. Oh-oka, M. Ikeuchi, M. Nango, Y. Amao, N. Kamiya and T. Dewa
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Journal Title
Res. Chem. Intermed.
Volume: 42
Pages: 7731-7742
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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