2015 Fiscal Year Research-status Report
卵細胞と精子のATPライブイメージングから生殖細胞のエネルギー代謝の総合理解へ
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15K07036
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
井尻 貴之 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (20629620)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 正道 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 非常勤講師 (70423150)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 卵細胞 / 精子 / ATP / ライブイメージング / エネルギー代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、生殖細胞におけるエネルギー代謝を総合的に理解することを目的としており、ツメガエル卵細胞を用いた解析とマウス精子を対象とした観察とを行っている。これらの研究において平成27年度は、卵細胞の方では成熟過程に絞って後に示すような結果を得ることができ、精子の方ではATPイメージングのための蛍光プローブが精子中で蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を起こすのを観察することに成功した。
成熟前後における卵母細胞でのATPの観察とATPが成熟に与える影響の解析：これまでにアルビノのツメガエル卵母細胞におけるATPライブイメージングの系を用いて、卵表層付近のATPは卵成熟誘導直後からしばらく増加を続けることがわかっている。この時に増加するATPの由来を調べるために解糖系の阻害剤（2DG）やATP合成酵素の阻害剤（OliA）を卵細胞に注入し、ATPの変化を観察した。ATP観察の結果は、現在、解析中である。また、ツメガエルの卵成熟にATP産生が重要であるかどうかを詳細に解析したが、ツメガエルの野生型の卵細胞は成熟すると表面にホワイトスポットが現れるので、それを指標にして成熟具合を判定した。この実験でも2DGやOliAを注入した後に成熟誘導し、ホワイトスポットの出現を観察することからATP合成阻害剤が卵成熟に及ぼす影響を調べた。その結果、ツメガエルでは卵成熟時に酸化的リン酸化だけでなく解糖系も働いていることを示唆するデータが得られ、興味深いことに、これらのATP合成阻害剤の影響によるホワイトスポット出現の遅れは、ATPをインジェクションすることでレスキューされた。これはATPがツメガエルの卵成熟においてシグナル分子として働いている可能性も示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
卵成熟過程におけるホワイトスポットの観察においては、野生型のツメガエル由来の卵細胞を用いてATP合成の阻害剤が成熟に及ぼす影響を重点的に調べた。その結果、ツメガエルの卵成熟時には酸化的リン酸化だけでなく解糖系も働いていることを示すのに十分なデータが得られつつある。
卵細胞表層付近でのATPライブイメージングに関しては、連携研究者の山口大の岩尾博士の研究室でアルビノのツメガエル由来の卵細胞を用いた観察実験を行った。こちらでも未成熟卵母細胞にATP合成の阻害剤を注入し、成熟誘導後の卵細胞表層付近のATPの変化を観察した。これまでに観察結果は十分に得られたが、データの解析は一部にとどまっている。しかしながら、少なくともミトコンドリアのATP合成酵素を阻害すると、阻害しない場合に比べてATPの増加開始が遅延し抑えられていることが示唆された。
精子ATPのライブイメージングでは蛍光ATPプローブをノックインしたマウス（ATeamノックインマウス）が必要であり、この雄マウスを増やすために多くの時間を費やした。これまでに、蛍光ATPプローブを細胞質で発現するATeamノックインマウスを用いて予備実験を行ったところ、凍結精子を復活させた後に顕微鏡で観察した場合でも弱いながらもFRETを観察することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者は平成28年4月より摂南大学理工学部生命科学科に講師として着任し、研究室主宰者として独立した研究室の運営をはじめた。平成28年度後期より学部3年生（例年6名程度）が配属されるため、卵母細胞へ試薬を注入するためのインジェクション装置等を揃えて、研究代表者の研究室で学生とともに本研究課題を遂行する計画である。
上記の理由で、研究代表者自身が山口大の岩尾博士の研究室で実験を行う機会が減る見込みである。そのため、卵細胞表層付近でのATPライブイメージングに関しては、受精前後の観察を進めるよりも、これまでに卵成熟過程での観察で蓄積したデータをもとに原著論文をまとめて成果を発表する予定である。必要な実験として、卵成熟過程におけるミトコンドリアやカルシウムの分布を調べることが考えられる。
精子ATPのライブイメージングの実験は、研究分担者の京都大の山本博士の研究室で実施している。これまでに、蛍光ATPプローブを細胞質で発現するATeamノックインマウスの精子でFRETを観察できたが、このFRETが実際の精子の生理的な機能を反映しているのかどうかを評価する。その上で活性化精子や先体反応後の精子を詳細に解析するが、必要に応じて解糖系や酸化的リン酸化の阻害剤も用いて精子ATPに対する影響を調べる。さらには、ミトコンドリアで蛍光ATPプローブを発現する精子を解析する計画であり、この蛍光ATPプローブを精子特異的に発現させるためにStra8-Creマウスと掛け合わせる。さらにカルシウムの伝達とATPの変化に相関関係があるのかどうかを調べるために、カルシウム指示薬と組み合わせたATPイメージングも行う予定である。
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| Causes of Carryover |
精子ATPイメージングを実施する大前提として、精子でのFRETを観察するために最適な条件をみつける必要があった。そのために、使用する顕微鏡やカメラの環境・設定、さらには精子の生理的な条件等を変えての様々な予備実験を行った。この予備実験に必要な雄マウスを増やすために平成27年度の大半の時間を費やしたことが次年度の使用額が生じた理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
精子でのFRET観察のための条件設定ができたので、平成28年度は、精子ATPイメージングの実験を本格的に行っていく。そのために今後は様々な試薬や培地を購入する必要が出てくるものと見込まれる。次年度の使用額はこれらの精子ATPイメージングに必要な試薬や培地の購入にあてる計画である。
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[Presentation] ATP metabolism in Xenopus laevis oocytes: Is ATP yielded by glycolysis during maturation?2015
Author(s)
Ijiri, T.W., Kishikawa, J., Imamura, H., Sakiie, M., Ueno, S., Iwao, Y., Yokoyama, K., Sato, K.
Organizer
第38回日本分子生物学会年会
Place of Presentation
神戸ポートピアホテル、神戸国際会議場、神戸国際展示場、神戸商工会議所（兵庫県・神戸市）
Year and Date
2015-12-01 – 2015-12-04
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[Presentation] Inhibition of ATP synthesis affects white spot occurrence and the increase of ATP during progesterone induced maturation in Xenopus laevis oocytes2015
Author(s)
Ijiri, T.W., Kishikawa, J., Imamura, H., Sakiie, M., Ueno, S., Iwao, Y., Yokoyama, K., Sato, K.
Organizer
Gordon Research Conference on Fertilization and Activation of Development
Place of Presentation
Holderness School（Holderness, NH, USA）
Year and Date
2015-07-19 – 2015-07-24
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